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水稻kh结构域蛋白OsKDP在APIP12介导的水稻免疫反应中的作用机制研究

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水稻KH结构域蛋白OsKDP在APIP12介导的水稻免疫反应中的作用机制...

中国植物病理学会第十一届全国会员代表大会暨2018年学术年会

作者：李亚朱明慧周波鲁国东生物农药与化学生物学教育部重点实验室/福建农林大学国际水稻所

水稻与稻瘟菌间存在广泛而特异的相互作用,是研究寄主与病原物互作的重要模式系统。无毒基因是病原物遗传因子,能诱发寄主植物产生抗病性,是稻瘟菌与水稻互作最重要的激发子。在之前有文章报道称,水稻Piz-t能够识别稻瘟病菌AvrPiz-t基因... 详细信息

水稻与稻瘟菌间存在广泛而特异的相互作用,是研究寄主与病原物互作的重要模式系统。无毒基因是病原物遗传因子,能诱发寄主植物产生抗病性,是稻瘟菌与水稻互作最重要的激发子。在之前有文章报道称,水稻Piz-t能够识别稻瘟病菌AvrPiz-t基因,前人的研究利用酵母双杂交筛选到了12个与AvrPiz-t存在互作的水稻蛋白AvrPiz-t Interacting Protein(APIPs),并证明APIP5、APIP6、APIP8、APIP10和APIP12都参与了水稻抗稻瘟病的免疫反应。本研究前期通过酵母双杂交对APIP12进行了互作蛋白筛选得到一个含kh domain蛋白(OsKDP)。因而,本研究从APIP12与OsKDP互作的关系上来继续研究稻瘟病菌AvrPiz-t介导的水稻抗稻瘟病免疫反应。目前通过单独酵母双杂交试验证明,APIP12与OsKDP蛋白的两种剪切方式(CDS1与CDS2)都存在较明显的互作。接着构建了水稻原生质体表达的载体,并与水稻核定位蛋白Histon进行共定位研究发现,无论是OsKDP-CDS1还是OsKDP-CDS2都定位在细胞核里,而没有发现APIP12蛋白的明确定位结果。之后构建了APIP12与OsKDP蛋白的原核表达载体,并在18℃条件下通过IPTG成功诱导三种蛋白。接下去,将利用Pull-down进一步验证APIP12与OsKDP的互作关系;同时,创建OsKDP的Crispr突变体和过表达植株,分析突变体植株的表型,最终阐明OsKDP在水稻免疫反应中的作用机制。

关键词：水稻 kh结构域 APIP12

来源： cnki会议评论

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神经系统特异性剪接因子NOVA研究进展

军事医学科学院院刊 2008年第6期32卷 571-574页

作者：韩冷李稚锋任长虹孟祥勋张成岗军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京100850 苏州大学生命科学学院苏州215123

神经-肿瘤腹侧抗原(NOVA)是第一个在哺乳动物中发现的组织特异性剪接因子,广泛分布于中枢神经系统,通过其kh结构域(kh domain)与靶基因mRNA前体中的YCAY基序(YCAY motif)结合,调控可变剪接过程。根据其与靶标结合位置的不同,NOVA作为剪... 详细信息

神经-肿瘤腹侧抗原(NOVA)是第一个在哺乳动物中发现的组织特异性剪接因子,广泛分布于中枢神经系统,通过其kh结构域(kh domain)与靶基因mRNA前体中的YCAY基序(YCAY motif)结合,调控可变剪接过程。根据其与靶标结合位置的不同,NOVA作为剪接调节因子具有双重作用,既可以增强剪接,也可以抑制剪接。NOVA作为剪接因子特异性地调控了神经突触中一组功能密切相关的基因。

关键词：神经系统突触基因表达神经-肿瘤腹侧抗原 kh结构域 YCAY基序剪接因子可变剪接

剑麻Ahkh1775基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建

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分子植物育种 2023年第15期21卷 4935-4940页

作者：汪询杨倩柯智周文钊杨子平吕玲玲海南大学园艺学院海口570228 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所湛江市热带作物遗传改良重点实验室湛江524091 怀化学院风景园林学院怀化418099

kh结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现Ahkh1775可能参与调控剑麻株芽的发育,但是其调控机制仍不清楚。kh结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。... 详细信息

kh结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现Ahkh1775可能参与调控剑麻株芽的发育,但是其调控机制仍不清楚。kh结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。为获得与Ahkh1775相互作用的蛋白,本研究克隆了Ahkh1775的完整编码框,构建了酵母双杂交诱饵载体,并检测了诱饵载体的毒性和自激活性。结果显示,克隆获得一个918 bp的编码框,成功构建了诱饵载体,诱饵载体无毒性,但存在自激活性,25 mmol/L的3-AT可以抑制诱饵载体的自激活性。本研究结果为进一步筛选与Ahkh1775相互作用的蛋白和深入研究Ahkh1775在剑麻中的功能提供依据。

关键词：剑麻 kh结构域基因克隆酵母双杂交诱饵载体

可诱导型睾丸特异性启动子Cre工具鼠的建立及HRB2细胞功能研究

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可诱导型睾丸特异性启动子Cre工具鼠的建立及HRB2细胞功能研究

作者：顾卫娟南京医科大学

学位级别：硕士

目的:构建睾丸支持细胞和精原细胞特异表达的2种可诱导型Cre工具鼠方法:通过设计合成引物PCR扩增出AMH和STRA8的启动子,用EcoR I和Spe I酶切后连接到同样用EcoR I和Spe I酶切的载体PCAG-ERT2-CRE-ERT2上。成功构建的质粒AMH-ERT2-CRE-E... 详细信息

目的:构建睾丸支持细胞和精原细胞特异表达的2种可诱导型Cre工具鼠方法:通过设计合成引物PCR扩增出AMH和STRA8的启动子,用EcoR I和Spe I酶切后连接到同样用EcoR I和Spe I酶切的载体PCAG-ERT2-CRE-ERT2上。成功构建的质粒AMH-ERT2-CRE-ERT2和STRA8-ERT2-CRE-ERT2再用Spe I酶切纯化回收线性化的DNA片段,稀释成2ng/μl的注射用DNA溶液。将其用显微注射的方法直接注入超排得到的C57BL/6受精卵的原核内,体外培养1-2小时后,移植到假孕ICR母鼠的输卵管内。待其怀孕产仔后,抽提鼠尾DNA,用PCR法检测仔鼠是否为转基因阳性小鼠。结果:成功构建了可诱导型AMH-ERT2-CRE-ERT2和STRA8-ERT2-CRE-ERT2载体质粒。AMH的DNA一共注射了205个受精卵。将180个存活的受精卵移植到9只假孕ICR母鼠的输卵管内,共得到94只仔鼠。PCR检测表明9只为转基因阳性小鼠。STRA8的DNA一共注射了164个受精卵。将147个存活的受精卵移植到7只假孕ICR母鼠的输卵管内,共得到58只仔鼠。PCR检测表明8只为转基因阳性小鼠。结论:用原核注射法成功制备出了睾丸支持细胞和精原细胞特异表达、可诱导型Cre重组酶转基因工具小鼠C57BL/6 FVB-Tg(AMH-ERT2-CRE-ERT2)和C57BL/6 FVB-Tg(STRA8-ERT2-CRE-ERT2)背景&目的:HRB2(HIV-1 rev binding protein 2)是一个由381个氨基酸残基组成的蛋白质,其对应基因全长3357bp,有一个长度为1143bp的开放阅读框架。HRB2蛋白在多种真核生物中存在同源蛋白。对这些同源蛋白的研究发现,HRB2蛋白参与广泛的生命活动,如参与核糖体合成、介导蛋白与蛋白间相互作用和在亚细胞中的定位等。目前对HRB2的研究在酵母中的研究比较深入,取得了很多成果,但对人源的HRB2的研究很少。本研究通过对人源HRB2的蛋白结构分析、同源比对、亚细胞定位、在传代细胞中的表达、RNA干扰以及对细胞周期的影响、HRB2与NYD-SP14的相互作用等研究,初步阐明人源HRB2的功能。方法:通过生物信息学软件分析比较HRB2与其同家族蛋白序列的相似性,分析其功能结构域,推测其功能;通过RT-PCR分析HRB2在常用传代细胞系中的表达;通过构建表达绿色荧光与HRB2融合蛋白的质粒,用激光共聚焦显微镜分析其亚细胞定位情况;设计并构建HRB2蛋白的RNA干扰质粒并抑制内源HRB2蛋白的表达,筛选合适的干扰质粒,通过划痕愈合实验、绘制生长曲线以及流式细胞分析研究HRB2基因对细胞周期的影响;共定位研究HRB2与NYD-SP14的相互作用及复合体在细胞中的定位。结果:HRB2在许多物种中存在,在不同的物种间具有高度的保守性。通过蛋白结构域分析发现HRB2蛋白中含有一个kh(hnRNP K homology domain)结构域,该结构域在真核生物中广泛并参与很多重要的生物功能。RT-PCR发现HRB2在Hela、293T、HEKTER等培养的细胞系中均有表达。在多种培养细胞系的研究中发现,HRB2定位在细胞核核仁位置上。我们设计了四种携带HRB2蛋白特异干扰序列的的RNA干扰质粒,通过用Real-Time PCR的方法验证它们对内源HRB2蛋白表达的抑制作用,结果表明二号和四号干扰质粒对内源HRB2的干扰效果较好。划痕愈合实验和绘制生长曲线的结果显示二号和四号靶点细胞株细胞生长受到抑制,但流式细胞分析的结果没有差异。细胞内源性NYD-SP14弥散分布在胞浆中,而免疫荧光实验分析说明在过表达HRB2的细胞中,NYD-SP14在胞浆中的含量明显降低,而和HRB2蛋白在核仁内形成复合体。结论:HRB2在多种生物中广泛表达且存在高度同源性。在传代细胞中,HRB2蛋白定位在核仁上。我们成功构建并筛选了携带有人HRB2基因的shRNA慢病毒载体及有效靶点,研究发现HRB2基因对细胞周期产生了影响。另外,HRB2与NYD-SP14之间有相互作用,HRB2/NYD-SP14蛋白复合体主要定位在核仁。

关键词： Cre重组酶转基因小鼠显微注射 kh结构域亚细胞定位 RNA干扰细胞周期免疫荧光蛋白相互作用

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Sam68及其在肿瘤形成中的作用

国际病理科学与临床杂志 2005年第4期25卷 324-327页

作者：郭恩琪综述吴育连审校浙江大学医学院附属第二医院外二科浙江杭州310009

Sam68是一种细胞内信号转导及RNA激活蛋白,通过自身的多个功能性模体与RNA,Src激酶家族及其他多种细胞内信号分子相作用。它作为细胞信号转导过程中的衔接蛋白参与细胞周期的调控,与细胞增殖和凋亡密切相关。其表达异常可导致细胞的恶... 详细信息

Sam68是一种细胞内信号转导及RNA激活蛋白,通过自身的多个功能性模体与RNA,Src激酶家族及其他多种细胞内信号分子相作用。它作为细胞信号转导过程中的衔接蛋白参与细胞周期的调控,与细胞增殖和凋亡密切相关。其表达异常可导致细胞的恶性转化。

关键词： Sam68 kh结构域 Src蛋白酪氨酸激酶细胞增殖和凋亡

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结构域酵母三杂交诱饵载体的构建及酵母转化

中国实用医药 2007年第22期2卷 1-3页

作者：马云李斌元徐向红刘慧婷贾瑜何淑雅南华大学生化与分子生物学研究所衡阳421001

目的脆性X相关蛋白(FXR1P)是一种RNA结合蛋白,本研究构建了其N-端结构域、kh结构域的酵母三杂交诱饵载体并转化酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2,为筛选这2种结构域的相互作用RNA作基础。方法根据Genebank提供的序列设计引物,以pYESTrp... 详细信息

目的脆性X相关蛋白(FXR1P)是一种RNA结合蛋白,本研究构建了其N-端结构域、kh结构域的酵母三杂交诱饵载体并转化酵母菌株L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2,为筛选这2种结构域的相互作用RNA作基础。方法根据Genebank提供的序列设计引物,以pYESTrp3/FXR1质粒作为模板,扩增分别包含FXR1P N-端结构域、kh结构域的编码区序列,连接到用于酵母三杂交文库筛选的pYESTrp3质粒,得到诱饵质粒,导入大肠杆菌Top10扩增,筛选阳性克隆并提取其中的重组质粒,再转化酵母菌L40 ura3/pHyblex/Zeo-MS2。结果经过测序验证,该重组诱饵质粒构建成功,转化酵母菌之后对宿主菌无毒性,无自激活现象。结论成功构建了能用于酵母三杂交文库筛选的FXR1P蛋白N-端结构域、kh结构域酵母三杂交诱饵载体,为研究这两个结构域的RNA结合功能奠定了基础。

关键词： FXR1P kh结构域 FXR1PN-端结构域酵母三杂交脆性X综合征

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多聚胞嘧啶结合蛋白结构与功能研究进展

生物学杂志 2015年第5期32卷 76-79页

作者：徐荣发周阳刘海涛施海峰江苏大学生命科学研究院镇江212013

Poly(c)-结合蛋白[Poly(c)-binding proteins,PCBPs]是RNA结合蛋白的重要分支,包含与核不均一蛋白hnRNP K同源的kh(the K homology domain)结构域,该结构域可识别并结合RNA。以PCBP1为例,它的kh结构域内,kh1与kh2之间的连接区均存在相对集中的纯化选择位点。PCBP能够在转录水平调控多种基因的表达并调控mRNA的稳定性,如对遗传性乳腺卵巢癌易感基因brca1(breast cancer 1,early onset)、细胞周期依赖性激酶抑制因子p21等的调控。近年来,PCBP作为铁的分子伴侣,与铁蛋白(Ferritin)、二价金属转运因子(DMT1)、铁转运蛋白(Ferroportin)、脱氧辅蛋白羟化酶(Deoxyhypusine hydroxylase,DOHH)相互作用,参与细胞内铁代谢成为研究热点。对PCBP调节多个基因转录、mRNA稳定性及在铁代谢中的最新研究进展进行综述。

关键词： RNA结合蛋白 kh结构域 mRNA DMT1 铁代谢