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慢性鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β与PI3K/Akt及白细胞介素6间的相关性

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慢性鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β与PI3K/Akt及白细胞介素6间...

作者：陈薇南昌大学

学位级别：硕士

目的：研究慢性鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）与PI3K/Akt信号通路以及细胞因子白细胞介素（interleukin，il）6之间的相关性。方法：分别用半定量逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）、免疫组... 详细信息

目的：研究慢性鼻窦炎鼻黏膜中糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase3β，GSK3β）与PI3K/Akt信号通路以及细胞因子白细胞介素（interleukin，il）6之间的相关性。方法：分别用半定量逆转录聚合酶联反应（RT-PCR）、免疫组化法检测30例慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP）患者、20例慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP）患者的组织标本以及20例鼻中隔偏曲患者的鼻黏膜标本中GSK3β、PI3K、Akt的mRNA和蛋白质的表达，并用半定量RT-PCR检测细胞因子il-6在CRSwNP组、CRSsNP组和对照组鼻黏膜中的表达。结果： GSK3β、PI3K、Akt、il-6mRNA在CRSwNP组中的相对表达量分别为0.6254±0.05837、0.8239±0.71856、0.9369±0.08226、0.8973±0.06795，在对照组分别为0.2684±0.07263、0.3578±0.09942、0.6721±0.05904、0.5898±0.08913，差异有统计学意义（t值分别为2.358、3.071、2.764、2.239，P值均＜0.05）。以上四项指标在CRSwNP组和CRSsNP组之间的表达差异无统计学意义（t值分别为1.597、1.842、1.468、0.926，P值均＞0.05）。GSK3β、PI3K、Akt蛋白主要表达在黏膜上皮细胞、黏膜下腺体细胞及炎性细胞中，阳性染色主要定位于胞质，其在慢性鼻窦炎鼻黏膜中的阳性表达率明显高于对照组的阳性表达率，差异有统计学意义（卡方值分别为16.42、16.25、15.57，P值均＜0.01）。GSK3β、PI3K、Akt蛋白在CRSwNP组和CRSsNP组的阳性表达率差异无统计学意义（卡方值分别为3.27、2.85、2.46，P值均＞0.05）。GSK3β与PI3K、Akt以及il-6在CRS患者中的表达呈正相关（r值分别为0.645、0.617、0.583，P值均＜0.01）。结论： il-6、PI3K/Akt、GSK3β在CRS鼻黏膜中的异常表达可能在CRS的发生、发展过程中发挥着一定的促炎作用。

关键词：慢性鼻窦炎 GSK3β PI3K/Akt il6

兔激素性股骨头缺血坏死PMMA股骨头内注射作用的初步研究

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兔激素性股骨头缺血坏死PMMA股骨头内注射作用的初步研究

作者：段祺辉昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]建立家兔激素性无菌性股骨头坏死动物模型,于股骨头内注射聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥,对其进行组织病理学的观察,通过ELISA法血清学检测和免疫组化检测,探讨植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥后股骨头骨界面周围骨组织VEGF、 TGF、il的表达... 详细信息

[目的]建立家兔激素性无菌性股骨头坏死动物模型,于股骨头内注射聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥,对其进行组织病理学的观察,通过ELISA法血清学检测和免疫组化检测,探讨植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥后股骨头骨界面周围骨组织VEGF、 TGF、il的表达,了解注入PMMA后周围骨组织损伤修复的情况,从而为治疗无菌性股骨头坏死提供理论依据。 [方法]选取家兔24只,随机分为3组：A组为对照组,B组为造模组、C组为治疗组,每组8只。B、C两组糖皮质激素臀部肌肉注射8-10周,诱导建立股骨头无菌性缺血坏死的动物模型,A组对照组以相同方法注射生理盐水。C组于第10周开始股骨头内注射PMMA,于第14周进行抽血血清学检测,并处死所有动物,分别进行组织病理学观察、界面骨组织免疫组化检测。 [结果]1.大体观察见实验组动物体重减轻,步态异常;2.影像学及病理学观察提示不同程度股骨头缺血坏死的阳性表现;3.造模组与治疗组动物血清学检测VEGF、TGF-β、il-6的含量均高于对照组,差异有统计学意义。治疗组与造模组间相比较无差异性;4.造模组股骨头标本免疫组化检测VEGF的表达低于对照组,治疗组高于造模组与对照组,差异有统计学意义。造模组TGF-β的表达与对照组比较无明显统计学差异,治疗组高于造模组与对照组,差异有统计学意义。 [结论]1.短期内大剂量使用糖皮质激素,可引起股骨头缺血坏死,可成功复制其动物模型;2. VEGF、TGF、il与股骨头缺血坏死发生发展以及病灶修复的一系列过程关系密切;3.股骨头内注射PMMA可以有效的增加病变股骨头的抗压强度,一定程度恢复其球形结构,减少股骨头塌陷的发生;4.植入PMMA后病变骨组织修复的过程中VEGF、TGF-β的表达增加;5.植入PMMA骨水泥未发现周围骨组织不可逆的损伤。

关键词：兔股骨头缺血坏死 PMMA VEGF TGF-β il6

基于网络药理学和分子对接探讨连花清瘟干预新型冠状病毒机制

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基于网络药理学和分子对接探讨连花清瘟干预新型冠状病毒机制

作者：赵天毓吉林大学

学位级别：硕士

研究背景新型冠状病毒疫情自2019年底暴发以来,由于其极具易感性和传播性,在全球呈现蔓延趋势。患者常伴随发热,干咳,乏力等症状,甚至引起肺部炎症和浸润,以及全身炎性细胞因子风暴。因此,COVID-19治疗药物的研究深受国际关注。在尚无... 详细信息

研究背景新型冠状病毒疫情自2019年底暴发以来,由于其极具易感性和传播性,在全球呈现蔓延趋势。患者常伴随发热,干咳,乏力等症状,甚至引起肺部炎症和浸润,以及全身炎性细胞因子风暴。因此,COVID-19治疗药物的研究深受国际关注。在尚无有效抗COVID-19药物的情况下,早期中药介入在控制炎症扩散,促进炎症吸收、阻断病程、缩短治疗周期等方面发挥了重要的作用。连花清瘟（LHQW）是呼吸系统疾病的一款常见特效中成药,借鉴我国古代名医治疗急性感冒、流感发热等呼吸道外感热病的古方经验,并结合我国现代最新药理学的研究研制而成,目前该中成药已成功被卫生部国家卫生健康委员会列为COVID-19医学观察期人群、临床治疗期轻型及普通型治疗的推荐用药。但是目前连花清瘟治疗COVID-19的具体机制尚不清楚。中药方剂具有多种成分、多个靶点、全身免疫调节等功效,网络药理学方法是深入研究中药方剂作用机制的一个独特有效的科学方法,分子对接技术可通过给活性成分与作用靶点的结合情况打分,虚拟筛选出可能有效的中药方剂或者中药材中的活性化合物,通过分子对接技术可以实现快速探索作用靶点,研究其药理活性和作用机制,为中药的现代化研究方法提供有效的技术支持。因此,本课题拟利用网络药理学和分子对接等手段从分子水平和蛋白水平探讨连花清瘟干预新型冠状病毒肺炎的机制。研究目的本课题通过网络药理学及分子对接的方法从分子水平和蛋白水平为连花清瘟治疗COVID-19的作用机制展开研究。阐明连花清瘟治疗COVID-19的活性单体化合物及潜在靶点,揭示连花清瘟在抑制炎症应激风暴及对于新冠病毒入侵宿主细胞受体ACE2的调控作用,同时构建SARS-CoV-2入侵宿主细胞过程中ACE2潜在新型共受体的筛选方法,为连花清瘟治疗COVID-19提供理论参考依据。研究内容及结果（1）连花清瘟通过多靶点调控COVID-19介导的细胞因子风暴本研究通过网络药理学分析,使用GeneCards数据库对COVID-19的致病靶点进行筛选结果表明COVID-19的致病核心靶点为TNF,次核心靶点为il6、GAPDH、TP53、il10、ALB、il2、MAPK3。使用 TCMSP、UniProt 数据库对连花清瘟的主要活性成分及作用靶点进行筛选结果表明连花清瘟的治疗核心靶点为 AKT1,次核心靶点为 ALB、MAPK3、il6、TP53、VEGFA、JUN、EGF。为进一步明确两者的共有靶点,本研究将COVID-19的致病靶点与连花清瘟的作用靶点相互映射,发现两者共有靶点共计45个,其中核心靶点为il6,次核心靶点为 TNF、MAPK8、CXCL8、TP53、MAPK3、il10、CASP3。并且由于 ACE2 是COVID-19侵入人体的重要受体,将上述45个COVID-19和连花清瘟的共有靶点与ACE2构建PPI网络,发现其中有8个与ACE2相关的靶点:ALB、NOS3、il6、CRP、CAT、TNF、CCL2、il1B。上述靶点多为炎性因子,因此提示连花清瘟可能通过调控上述多种炎症因子介导的细胞因子风暴,从而发挥治疗COVID-19的作用。使用R语言对45个共有靶点进行功能注释,GO富集分析显示,最显著的生物学过程为对脂多糖的反应（responsetolipopolysaccharide）,共有24个靶点参与此过程,其中包含核心靶点il6以及5个与ACE2相关靶点（NOS3、il6、TNF、CCL2、il1B）,提示连花清瘟可能通过抑制脂多糖的反应,减少多种炎症因子的释放来缓解LPS造成的肺部损伤。KEGG通路分析显示,最显著的KEGG通路为 AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway）,共有 19 个靶点参与此通路,其中包含核心靶点il6以及5个与ACE2相关靶点（NOS3、il6、TNF、CCL2、il1B）,提示连花清瘟可能通过调控AGE-RAGE信号通路中的多个靶点的表达,从而减少通路下游炎症因子的释放来缓解组织细胞损伤。（2）连花清瘟通过多成分调控核心靶点、次核心靶点及与ACE2相关靶点本研究使用CDOCKER（Discovery Studio）对接程序将相关靶点与连花清瘟中的活性成分进行蛋白-小分子对接,结果显示β-胡萝卜素、异牡荆苷、贯叶金丝桃素等13种活性成分与核心靶点（il6）;次核心靶点（TNF、MAPK8、CXCL8、TP53、MAPK3、il10、CASP3）;ACE2;与 ACE2 相关靶点（ALB、NOS3、il6、CRP、CAT、TNF、CCL2、il1B）均显示出较好的结合活性。因此提示连花清瘟可能通过多种活性成分作用于上述靶点发挥调节炎症反应的作用。（3）连花清瘟通过多成分调控ACE2与Spike的结合本研究使用CDOCKER（Dis

关键词：连花清瘟 COVID-19 il6 ACE2 共受体

小檗碱对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用及机制研究

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小檗碱对阿霉素肾病大鼠的肾脏保护作用及机制研究

作者：李吉镇济宁医学院

学位级别：硕士

目的:肾病综合征（Nephrotic syndrome,NS）是常见的肾小球疾病,由于病理类型多样,治疗效果不同,预后也各有不同。本研究通过选取SD大鼠建立阿霉素肾病综合征模型,应用小檗碱（Berberine,BBR）灌胃治疗,比较不同分组的阿霉素肾病大鼠的2... 详细信息

目的:肾病综合征（Nephrotic syndrome,NS）是常见的肾小球疾病,由于病理类型多样,治疗效果不同,预后也各有不同。本研究通过选取SD大鼠建立阿霉素肾病综合征模型,应用小檗碱（Berberine,BBR）灌胃治疗,比较不同分组的阿霉素肾病大鼠的24小时尿蛋白、血浆蛋白、肝功能、血脂、肾功能以及肾脏组织形态学的变化,评估BBR能否对阿霉素肾病大鼠起保护作用;同时探索BBR对阿霉素肾病大鼠的作用机制。方法:首先建立阿霉素肾病大鼠模型,选择健康的雄性SD大鼠40只,随机平均分为正常（Normal）组、模型（Model）组、小檗碱治疗（BBR）组、泼尼松治疗（PED）组。取30只大鼠通过单次尾静脉注射阿霉素5mg/kg,分别留取造模后第1周、第2周24小时尿液,待尿液收集结束后,造模成功大鼠开始灌胃治疗,BBR浓度为100mg/（kg·d）,PED浓度为1 mg/（kg·d）,灌胃8周后再次留取BBR组、PED组尿液,后处死四组大鼠,留取空腹血液和肾脏组织。全自动生化仪检测不同分组大鼠的肝功能、肾功能、24小时尿蛋白、血脂、血糖等水平。利用PAS染色方法观察四组大鼠肾脏组织病理变化,免疫组织化学方法检测大鼠肾脏组织中NF-κB因子的表达。结果:对于Model组,2周后24h尿蛋白定量高于Normal组,差异有统计学意义（P＜0.05）,表明造模成功。BBR组、PED组24h尿蛋白定量、肾功能均低于Model组,差异有统计学意义（P＜0.05）。Model组肾小球增大,系膜区增宽,肾小管可见糖原沉积,肾小管上皮细胞的细胞核脱落形成管型;BBR组、PED组病理改变较Model组减轻。BBR组、PED组较Model组相比可以调节血脂代谢紊乱,差异有统计学意义（P＜0.05）。与PED治疗相比,BBR治疗具有降低血糖的优势。与Model组相比,BBR组、PED组NF-κB、il6表达水平降低,血清SOD表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:BBR可改善阿霉素肾病大鼠的尿蛋白水平,减轻肾脏损伤;其机制可能是通过降低NF-κB、il6的表达水平,同时升高血清SOD的水平,抑制炎症反应、抑制氧化应激,进而发挥肾脏保护作用。

关键词：小檗碱阿霉素 NF-κB SOD il6

香菇多糖联合化疗治疗中晚期胃肠道肿瘤疗效观察

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香菇多糖联合化疗治疗中晚期胃肠道肿瘤疗效观察

作者：张云芳湖北中医学院

学位级别：硕士

目的观察香菇多糖联合化疗治疗中晚期胃肠道肿瘤对患者免疫功能的影响,并评价其安全性,探讨中医学扶正治疗与免疫调节相关关系,寻找中西医结合防治恶性肿瘤的结合点。方法 1入选标准:(1)所有患者均符合中华人民共和国卫生部医政司编... 详细信息

目的观察香菇多糖联合化疗治疗中晚期胃肠道肿瘤对患者免疫功能的影响,并评价其安全性,探讨中医学扶正治疗与免疫调节相关关系,寻找中西医结合防治恶性肿瘤的结合点。方法 1入选标准:(1)所有患者均符合中华人民共和国卫生部医政司编著的《中国常见恶性肿瘤诊治规范》中原发性胃癌、大肠癌诊断标准,经组织学或细胞学证实,按世界卫生组织的TNM分期确诊的Ⅲa、Ⅲb、Ⅳ期胃癌、大肠癌患者。(2)患者年龄在18～75岁之间,体力状况(Karnofsky评分)大于60分,估计生存期超过3个月。(3)各项检查指标均符合化疗适应证,入选观察时已停止放、化疗一个月以上。(4)所有病例均已排除患有自身免疫性疾病患者,停止服用免疫抑制剂半年以上。 2纳入有效病例62例,将符合纳入标准的患者简单随机分为二组,治疗组32例,对照组30例,两组患者在年龄、性别、病理类型、临床分期、KPS等方面均无显著性差异(P＞0.05),具有可比性。两组患者化疗方案均为奥沙利铂方案。化疗方案为:奥沙利铂(L-OHP)130mg/m加5%葡萄糖注射液250ml静脉滴注2h,第1天;亚叶酸钙(CF)200mg加0.9%氯化钠注射液250ml避光静脉滴注2h,第1～5天;氟尿嘧(5-FU)500mg/m加5%葡萄糖注射液750ml,持续滴注6h,第1～5天;每21d为1个疗程。两组病例每次化疗前半小时均给予盐酸格拉司琼注射液3mg静脉滴注止吐,两组患者在出现Ⅲ度恶心、呕吐时均给予胃复安20mg肌注。而治疗组还于化疗前3d开始给予香菇多糖1mg加0.9%氯化钠注射液100ml静脉滴注,3次/周,3周为1疗程。连续观察两个化疗周期,从化疗日开始记录至该周期化疗结束后第3天。选择silR、il、il2及T3、T4/T8、NK细胞为监测免疫功能的参考指标,通过观察治疗组和对照组的免疫功能,来判定临床用药的效果;通过观察两组患者治疗前后体力体重变化,血常规,肝肾功能,心电图的变化,消化道反应及神经毒性等来判定临床用药的安全性;并初步推测silR、il可作为肿瘤治疗疗效判断的指标。结果 1治疗组两个疗程化疗完成率为100%(32/32),高于对照组96.7%(29/30),但两组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。 2治疗后对免疫功能的影响,经统计学分析两组化疗前各项指标无显著性差异(P＞0.05),具有可比性。化疗后,治疗组NK细胞活性,T3、T4/T8指标与治疗前相比有所提高,而对照组则三项指标下降,两组比较差异有显著性(P＜0.05);T4、T8两组比较差异无显著性(P＞0.05)。治疗后治疗组silR、il与治疗前相比下降,il2上升,治疗前后差异有显著性(P＜0.05);对照组与治疗前相比silR、il有所上升,il2有所下降,但差异无显著性(P＞0.05);两组比较差异有显著性(P＜0.05)。 3两组患者两周期化疗后近期疗效比较,两组无显著性差异(P＞0.05)。 4对于疗效较好的患者,治疗后其silR、il水平的变化与疗效差者相比较,差异具有显著性(P＜0.05)。 5两组患者治疗前后体力、体重变化情况比较:两个周期化疗后,两组患者的体力状况(Karnofsky)和体重均有所下降;化疗后,治疗组的体力状况明显优于对照组(P＜0.05),体重水平稍高于对照组,但无显著性差异(P＞0.05)。 6两组患者毒副反应比较:治疗后,Ⅲ度恶心呕吐、腹泻发生率治疗组为6.25%,对照组为6.90%,两组比较无显著性(P＞0.05);Ⅲ～Ⅳ度白细胞减少治疗组为25%,而明显低于对照组51.72%(P＜0.05);两组患者血红蛋白与血小板的变化经统计学处理无显著性差(P＞0.05);神经毒性发生率治疗组为21.88%,对照组为34.48%,两组比较无显著性(P＞0.05);两组患者肝、肾功能及心电图的变化经统计学处理无显著性差(P＞0.05)。结论香菇多糖联合化疗可提高患者的免疫功能,改善患者的一般状况,减轻了化疗药物的毒副作用,同时对化疗有增效作用,临床应用安全有效。选择silR、il、il2三个细胞因子作为监测免疫功能的指标,同时silR、il可作为肿瘤治疗疗效判断的指标。

关键词：香菇多糖免疫功能 sil2R il6 il12

基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表达策略的研究

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基于转座子载体高压注射的免疫缺陷小鼠体内多种人淋巴因子长期表...

作者：范伟吉林大学

学位级别：硕士

研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导... 详细信息

研究目的:免疫系统人源化小鼠是研究最多应用最广的人源化小鼠之一,其特点是具有人的免疫系统,被认为是生物医药领域研究的理想小动物模型。经过几十年的研究和发展,该模型日趋成熟。但因缺乏某些人类细胞发育存活所必需的细胞因子,导致某些血系细胞重建效果不佳。有报道显示小鼠il 4、GM-CSF、CSF、il 3等细胞因子有种属特异性,与人类细胞无交叉反应。外源补充人il15、EPO及il 3给免疫系统人源化小鼠可增加人NK和红细胞的重建比例。因此,补充合适的细胞因子可弥补当前人源化小鼠模型髓系和红系细胞重建不佳的缺陷,使该模型得到更广泛的应用。因此本课题通过构建含有人il 6、il 3、il 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒,利用PiggyBac(PB)转座子体系将目的基因整合到宿主小鼠细胞基因组中实现长期表达,以此优化免疫系统人源化小鼠模型。研究方法:利用分子生物学手段构建含有人il 6、il 3、il 15、SCF、GM-CSF五种细胞因子的表达质粒(PB-5F);经氨苄青霉素培养基筛选,挑取单克隆进行NheI和BamHI双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有目的基因大小的阳性克隆;阳性克隆送库美生物科技有限公司测序;采用细胞转染技术将含有绿色荧光蛋白基因的转座子质粒(PB-GFP)和PB转座酶质粒(Super PB)按2.5:1的比例共转染进入293T细胞系,利用倒置荧光显微镜和流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达;将目的质粒(PB-5F)(50μg/只)和Super PB(20μg/只)混合后高压注射入NCG免疫缺陷小鼠体内,在确定的时间点取小鼠血清,应用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分别检测5种细胞因子的表达、含量及持续时间。研究结果:PB-5F质粒经过双酶切和琼脂糖凝胶电泳证明,插入片段与目的基因5F片段大小相符,测序结果证明插入序列与5F基因序列一致。体外细胞转染实验显示,在细胞转染7天内瞬时转染组GFP阳性率与稳定转染组没有明显差异;随后瞬时转染组几乎检测不到GFP的表达,而稳定转染组可以维持30天以上的表达。小鼠血清中人的细胞因子在注射后第5天瞬时转染组和稳定转染组各细胞因子之间无统计学差异,与体外转染实验结果一致;2个月后稳定转染组依然能检测到人细胞因子的表达。研究结论:(1)成功构建了含有人il 6、il 3、il 15、SCF、GM-CSF基因的PB转座子质粒PB-5F;(2)PB转座子体系可维持人类细胞因子在小鼠体内的长期表达。

关键词：免疫系统人源化小鼠 il6 il3 il15 SCF GM-CSF 转座子

MEKK3在TNF-α刺激后恶性肿瘤细胞产生il-6作用中的初步研究

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MEKK3在TNF-α刺激后恶性肿瘤细胞产生IL-6作用中的初步研究

作者：沈瑞明福建医科大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的头号杀手,许多细胞因子与恶性肿瘤密切相关。大量研究发现,肿瘤细胞自身分泌或接受致炎因子(TNF-a等)刺激后产生的细胞因子il-6,与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及化疗抵抗作用等预后不良密切相关。在查... 详细信息

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的头号杀手,许多细胞因子与恶性肿瘤密切相关。大量研究发现,肿瘤细胞自身分泌或接受致炎因子(TNF-a等)刺激后产生的细胞因子il-6,与恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移及化疗抵抗作用等预后不良密切相关。在查阅大量文献和原有工作的基础上,本研究应用RNA干涉(siRNA)、基因克隆、基因转染、Western-blot、荧光实时定量PCR、RT-PCR和ELISA技术,探讨有丝分裂原激活的蛋白激酶MEKK3在TNF-a刺激后的恶性肿瘤细胞所产生的il-6中的作用,旨在为阐明恶性肿瘤细胞中TNF-a介导的il-6产生的机制和发现可能的治疗药物作用的靶点奠定基础。肺癌是高度恶性的肿瘤,其死亡率占恶性肿瘤的第一位;乳腺癌是世界各地女性中最为常见的恶性肿瘤,也是导致女性死亡的主要原因之一。因此,本课题选择肺癌和乳腺癌细胞进行研究。本研究第一部分首先应用ELISA方法检测肺癌A549细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后il-6的产生。结果表明：在接受TNF-a刺激后,A549细胞和MDA-MB-231细胞均能产生较高水平的il-6。在此基础上,应用Western-blot和RT-PCR方法分别检测了A549细胞和MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后MEKK3的磷酸化及MEKK3基因表达的改变,以判断其是否是TNF-a信号途径的成分。Western-blot结果表明：A549细胞接受TNF-a刺激后10min,MEKK3即发生磷酸化,30min达高峰,2h后恢复正常;MDA-MB-231细胞接受TNF-a刺激后30min发生磷酸化,1h达高峰,2h后亦恢复正常。RT-PCR结果显示：与未刺激的样本对比,两种细胞接受TNF-a刺激后,MEKK3 mRNA表达均明显增加。Western-blot结果和RT-PCR结果均表明：MEKK3可被TNF-a激活、MEKK3是TNF-a信号途径的信号分子,其接受TNF-a刺激后磷酸化的出现与改变及其mRNA表达的改变相似于文献报道的其他蛋白激酶因接受细胞因子刺激而活化后的磷酸化和基因表达的改变。以第一部分的结果为依据,本研究的第二、三、四部分着眼于探讨MEKK3是否参与TNF-a刺激后恶性肿瘤细胞所产生的il-6的调控。本研究第二部分应用Ambion公司siRNA设计软件设计针对MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,在体外合成相应的DNA片段后,以BamHI及HindⅢ酶切位点分别克隆入pSilencer 4.1-CMV hygro载体,构建成四个针对MEKK3基因的siRNA表达载体—pSilencer4.1-MEKK3siRNA,再以脂质体(Lipofectamine2000)分别将其转染入A549细胞,应用Western-blot检测MEKK3 siRNA表达载体对MEKK3表达的抑制。结果发现,四个MEKK3 siRNA表达载体对MEKK3的表达均有抑制作用,其中pSilencer4.1-MEKK3 siRNA2的抑制作用最为显著,抑制率达84%,因此选择将其分别转染入A549和MDA-MB-231细胞,潮霉素筛选后获得的抗性细胞克隆株,经荧光实时定量PCR测定后,结果显示MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231稳定克隆株中MEKK3的表达均获得了80%以上的抑制,保证了后续的研究。本研究第三部分首先应用RT-PCR,扩增MEKK3基因的全长cDNA序列,通过KpnI和XhoI酶切位点克隆入pcDNA3.1/hygro(+)载体中,构建pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表达载体,并转染入A549和MDA-MB-231细胞中。Western-blot结果显示MEKK3蛋白在此两种细胞中均表达良好。应用潮霉素筛选获得的两种细胞的稳定细胞克隆株,经荧光实时定量PCR检测后发现,其MEKK3 mRNA的表达水平与空载体稳定细胞克隆株相比,均有显著增加(分别增加了195%和177%)。结果表明pcDNA3.1/hygro(+)-MEKK3真核表达载体构建成功,且成功地获得了MEKK3高表达稳定细胞克隆株,进一步保证了后续的研究。本研究第四部分分别应用RT-PCR和ELISA检测TNF-a刺激未转染的A549和MDA-MB-231细胞(野生株)、MEKK3低表达的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231稳定细胞克隆株、将MEKK3基因重新转染入MEKK3低表达的MEKK3 siRNA2/A549和MEKK3 siRNA2/MDA-MB-231并经RT-PCR验证恢复了MEKK3表达的细胞、A549和MDA-MB-231siRNA阴

关键词：肺癌和乳腺癌细胞 TNF-a il6 MEKK3 ELISA Western-blot siRNA技术基因克隆和基因转染荧光实时定量PCR

基于网络药理学和分子对接的中药菊花治疗视神经病变的作用机制分析

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现代盐化工 2024年第2期51卷 14-16页

作者：张宇婷胡依彤辽宁何氏医学院辽宁沈阳110000

通过TCMSP数据库对菊花活性成分进行筛选,预测菊花活性成分的潜在靶点并收集该疾病的靶点。分析构建中药成分靶点网络,蛋白互作(PPI)网络以及核心靶点,根据靶点GO分析和KEGG通路富集分析,由分子层面验证菊花有效成分同关键靶点分子的对... 详细信息

通过TCMSP数据库对菊花活性成分进行筛选,预测菊花活性成分的潜在靶点并收集该疾病的靶点。分析构建中药成分靶点网络,蛋白互作(PPI)网络以及核心靶点,根据靶点GO分析和KEGG通路富集分析,由分子层面验证菊花有效成分同关键靶点分子的对接状况。在治疗视神经病变方面,菊花有效成分主要涉及木犀草素、山萘酚、槲皮素与金合欢素。通过调控关键靶点蛋白TNF、il6、il1B、JUN、TP53、VEGFA、EGFR、CCL2、CAT、PPARG表达,涉及氧化应激反应,细胞对氮化合物的反应,细胞凋亡与衰老、炎症反应等,减缓神经发生病变。研究结果表明菊花可能通过多组分、多靶点、多途径治疗青光眼,但这一结果还需更多实验验证。

关键词：菊花槲皮素木犀草素视神经病变网络药理学氧化应激反应 TNF il6 il1B

丙泊酚对内毒素诱导人单核细胞释放细胞因子和表达SOD1蛋白的影响

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海南医学 2013年第24期24卷 3592-3594页

作者：孙艺娟黄希照胡祖荣杨世辉罗辉宋匀韵广东省妇女儿童医院麻醉科广东广州510010

目的观察丙泊酚对内毒素(LPS)诱导人单核细胞(THP-1)表达超氧化物歧化酶(SOD1)的影响及对细胞因子释放的影响。方法将体外培养的人单核细胞THP1细胞分为四组:正常对照组(C组)、LPS刺激组(L组)、丙泊酚处理组(P组)和丙泊酚预处理合并LPS... 详细信息

目的观察丙泊酚对内毒素(LPS)诱导人单核细胞(THP-1)表达超氧化物歧化酶(SOD1)的影响及对细胞因子释放的影响。方法将体外培养的人单核细胞THP1细胞分为四组:正常对照组(C组)、LPS刺激组(L组)、丙泊酚处理组(P组)和丙泊酚预处理合并LPS刺激组(P+L组),并用Western blot法检测各组内SOD1含量的变化。采用ELISA法检测四组不同处理因素对THP1细胞分泌il6、il8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。结果在LPS刺激12 h后收集细胞,与对照组比较L组中SOD1的表达量明显降低,il6、il8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)均明显增高(Pil6、il8、TNF-α均明显降低(Pil6、il8、TNF-α的大量释放和逆转LPS刺激下对THP1细胞内SOD1表达的抑制。

关键词：丙泊酚 THP1细胞 LPS SOD1 il6 il8 肿瘤坏死因子α(TNF-α)