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作者：王德刚汕头大学

学位级别：硕士

【背景与目的】在众多的免疫避孕候选抗原中，精子抗原被认为是目前最有希望和最具应用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年，一种新的精子特异表达的精卵融合关键蛋白izumo的发现可能为避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本课题旨在研究... 详细信息

【背景与目的】在众多的免疫避孕候选抗原中，精子抗原被认为是目前最有希望和最具应用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年，一种新的精子特异表达的精卵融合关键蛋白izumo的发现可能为避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本课题旨在研究原核表达的重组小鼠izumo(mlzumo)蛋白的免疫避孕潜力，为重组mlzumo蛋白是否能作为避孕疫苗候选靶抗原提供实验数据和科学依据。【材料与方法】①构建pET28a(+)-mlzumo原核表达质粒;②在大肠杆菌中表达带有6His纯化标签的重组蛋白6His-mlzumo;③固化Ni亲和层析纯化重组蛋白6His-mizumo，并透析复性和Bradford法定量;④通过腹腔注射用6His-mizumo免疫雌雄性C57BL／6小鼠;⑤Western blot检测免疫小鼠血清抗6His-mlzumo IgG抗体的特异性;⑥ELISA检测血清特异性抗体滴度随免疫时间变化的规律;⑦精卵融合试验观察免疫血清对小鼠体外精卵融合的影响;⑧双荧光染色法对抗6His-mlzumo IgG抗体在精子上的识别部位进行定位;⑨免疫小鼠在末次免疫后第2周与正常小鼠合笼，评价其生育力。【结果】①成功构建了pET28a(+)-mizumo原核表达质粒;②成功表达和得到了纯化的重组蛋白6His-mlzumo;③雌性和雄性免疫小鼠体内都能产生血清特异性抗6His-mizumoIgG抗体，特异性抗体与天然mlzumo存在交叉反应;④血清特异性抗6His-mizumo IgG抗体开始出现在第一次加强免疫后第2周，末次免疫后第2周抗体滴度达到最高并至少持续到末次免疫后第6周;⑤6His-mlzumo免疫血清完全阻断小鼠体外精卵融合的发生;⑥抗6His-mlzumo IgG抗体特异地识别的小鼠AR精子(发生了顶体反应的精子)头部顶体区;⑦雌性和雄性免疫小鼠的生育力与PBS对照组相比没有明显降低。【结论】通过pET原核表达系统成功制备带有6His纯化标签的重组蛋白6His-mlzumo：6His-mlzumo对于雌性和雄性小鼠都具有免疫原性;虽然免疫重组mlzumo蛋白能够使小鼠产生特异识别小鼠AR精子头部顶体区并能阻断体外精卵融合的血清特异性IgG抗体，但对雌性和雄性免疫小鼠生育力的影响不明显。因此，原核表达的重组mlzumo蛋白可能对免疫小鼠没有明显的避孕作用，izumo是否能作为避孕疫苗研制的靶抗原还需要进一步的研究和探索。

关键词： izumo 精卵融合免疫避孕精子抗原亲和层析

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绒山羊izumo基因的克隆及组织表达

绒山羊Izumo基因的克隆及组织表达

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作者：梁磊内蒙古农业大学

学位级别：硕士

哺乳动物的受精过程,是一个精密而有序的细胞之间的相互作用的过程,其最终的结果就是精卵间通过质膜融合作用,成为受精卵。目前,科学家们虽然通过基因组学理论和蛋白质组学技术在精子表面上发现了数量可观的与受精相关的分子,但是精卵... 详细信息

哺乳动物的受精过程,是一个精密而有序的细胞之间的相互作用的过程,其最终的结果就是精卵间通过质膜融合作用,成为受精卵。目前,科学家们虽然通过基因组学理论和蛋白质组学技术在精子表面上发现了数量可观的与受精相关的分子,但是精卵融合过程是在顶体反应发生之后才进行的,其中精子和卵细胞的质膜必须通过相匹配的受体结合,而这个引发精卵融合的分子机制究竟是怎样运作目前还不清楚。在这些已经获得的与精卵融合过程相关的分子中,只有近期在精子上发现的IGSF(免疫球蛋白超家族)新成员izumo基因,经过基因敲除的小鼠实验,证明它是精卵融合所必需的。内蒙古白绒山羊作为一种内蒙古地区培育多年的家畜,是羊毛和羊绒的主要来源之一。由于izumo基因的发现对于了解绒山羊的受精机制有重要的指导意义,为了研究其在内蒙古白绒山羊精卵融合中的分子机制,本实验根据GenBank中已发表的牛的izumo核苷酸序列,设计并合成了扩增绒山羊izumo基因的1对引物,实验采用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)扩增获得了izumo基因部分序列,并对izumo基因进行了克隆和序列分析。在此基础之上,以得到的绒山羊izumo部分序列为模板,采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术,扩增了雄性成年内蒙古白绒山羊睾丸组织中izumo基因的全长序列,并钓取了该基因的CDS(编码区)。另外本实验还制备了地高辛标记的绒山羊izumo cDNA探针,用利用RNA Northern印记技术,对内蒙古白绒山羊izumo RNA进行分析,从而测定总RNA中编码izumo基因的mRNA分子的大小和表达丰度。 1、通过RT-PCR技术,获得484 bp的izumo基因cDNA序列,与牛的izumo基因同源性高达98%。 2、通过RACE技术,获得1536 bp的全长序列,钓取到1035 bp的izumo基因编码区序列,该编码区编码344个氨基酸。 3、通过对绒山羊睾丸和附睾的头、体、尾部组织izumo基因mRNA的RT-PCR组织表达鉴定,以及对该基因mRNA的Northern印迹鉴定,结果睾丸和附睾的头部、体部、尾部组织均显示阳性条带。 4、本研究为进一步进行绒山羊izumo基因在精卵融合过程中的功能研究奠定了基础。

关键词：内蒙古白绒山羊 izumo 克隆 RT-PCR RACE Northern

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重组小鼠izumo的表达及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响

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癌变．畸变．突变 2007年第3期19卷 230-234页

作者：王德刚黄天华谢庆东安刚汕头大学医学院生殖医学研究中心广东汕头515041

背景与目的:精子膜蛋白izumo在精卵融合中起关键作用。本研究旨在表达和纯化重组小鼠izumo蛋白(mizumo),探讨重组mizumo在小鼠体内的免疫原性及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响。材料与方法:将编码mizumo蛋白的cDNA序列亚克隆到pE... 详细信息

背景与目的:精子膜蛋白izumo在精卵融合中起关键作用。本研究旨在表达和纯化重组小鼠izumo蛋白(mizumo),探讨重组mizumo在小鼠体内的免疫原性及其特异性抗体对小鼠体外精卵融合的影响。材料与方法:将编码mizumo蛋白的cDNA序列亚克隆到pET28a(+)原核表达载体上,构建pET28a(+)-mizumo重组质粒。在BL21(DE3)大肠杆菌中表达重组6His-mizumo融合蛋白,并通过Ni2+亲和层析纯化。使用福氏佐剂乳化纯化的6His-mizumo,分别免疫雌性和雄性C57BL/6小鼠,并采集免疫前和免疫后血清。用Western Blot和ELISA检测血清中抗6His-mizumoIgG抗体的特异性和滴度。采用IVF和精卵融合试验检测血清中抗6His-mizumo抗体对小鼠精卵融合的影响。结果:纯化的6His-mizumo在SDS-PAGE凝胶上显示为约60kD的单一条带。免疫了重组蛋白的雌性和雄性小鼠都产生了抗6His-mizumoIgG抗体。抗6His-mizumoIgG抗体与重组蛋白,小鼠睾丸、附睾及精子膜蛋白存在交叉反应,免疫印迹显示为约60kD的特异性条带。ELISA结果表明,免疫6His-mizumo后至少6周之内,血清中的抗6His-mizumoIgG抗体维持在最高水平。免疫后血清处理组的小鼠精子与去透明带卵母细胞发生胞膜融合的能力明显低于免疫前血清处理组(Pizumo融合蛋白能够诱发雌性和雄性小鼠产生可阻断精卵融合发生的特异性血清抗体。因此,6His-mizumo可作为同种异体抗原用于免疫避孕候选疫苗的研究。

关键词： izumo 亲和层析精卵融合免疫血清免疫避孕

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绒山羊精子特异性膜蛋白izumo的克隆及其序列分析

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甘肃畜牧兽医 2010年第3期40卷 5-8页

作者：梁磊娜仁花内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

精子膜蛋白izumo在精卵融合的过程中具有重要的作用。为了探讨izumo基因在内蒙古白绒山羊精卵融合中的作用,根据GenBank中发表的牛的核苷酸序列,设计并合成了扩增izumo基因的1对引物,经RT-PCR扩增获得了izumo基因部分序列,并对izumo基... 详细信息

精子膜蛋白izumo在精卵融合的过程中具有重要的作用。为了探讨izumo基因在内蒙古白绒山羊精卵融合中的作用,根据GenBank中发表的牛的核苷酸序列,设计并合成了扩增izumo基因的1对引物,经RT-PCR扩增获得了izumo基因部分序列,并对izumo基因进行了克隆和序列分析。结果显示,获得484 bp的izumo基因cDNA序列,与牛的izumo基因同源性高达98%。

关键词：内蒙古白绒山羊 izumo RT—PCR 克隆

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Unraveling the intricacies of mammalian fertilization

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Asian Journal of Andrology 2014年第6期16卷 801-802页

作者： Satish K Gupta Reproductive Cell Biology Lab National Institute ofImmunology New Delhi 110067 India.

It is imperative to understand the molecular basis of various steps involved during fertilization. In the manuscript by Bianchi et al.1 a novel protein, Juno on egg membrane （oolemma） has been characterized that binds to sperm specific protein, izumo-1. Monoclonal antibodies against Juno inhibited in vitro fertilization. Juno knock-out female mice failed to deliver litters on mating. It is rapidly shed from oolemma after fertilization, suggesting its role in preventing polyspermy. Taken together these studies will help in our understanding of sperm-egg recognition mechanisms and also facilitate development of new fertility treatment regimens and novel contraceptives.

关键词： EGG INTEGRIN ALPHA-6-BETA-1 GAMETE RECOGNITION SPERM MICE RECEPTOR PROTEIN BINDING izumo

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pCXN2-mizumo对小鼠C57BL/6生育能力的影响

pCXN2-mIZUMO对小鼠C57BL/6生育能力的影响

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作者：安刚汕头大学

学位级别：硕士

【背景与目的】寻找方便而高效的手段来对人类进行计划生育和控制某些有害动物的数量一直是科学家们感兴趣的课题。随着基因工程和免疫学技术的发展，应用免疫避孕疫苗控制人或动物的生育能力成为很多国家、尤其是发展中国家研究的重点... 详细信息

【背景与目的】寻找方便而高效的手段来对人类进行计划生育和控制某些有害动物的数量一直是科学家们感兴趣的课题。随着基因工程和免疫学技术的发展，应用免疫避孕疫苗控制人或动物的生育能力成为很多国家、尤其是发展中国家研究的重点。不同于传统意义上的感染性疾病疫苗，免疫避孕疫苗是人为地干扰正常健康机体的生殖生理过程。而基因免疫是20世纪90年代发展起来的一种新的免疫技术，是将抗原基因重组到真核表达载体上，经过一定的方法转染到动物机体细胞内，表达的抗原经过抗原提呈激活机体免疫系统，从而诱导产生特异性的体液免疫和／或细胞免疫应答。2005年3月，日本学者Naokazu Inoue等人第一次发现了izumo蛋白，并证实这种蛋白在精卵融合中起关键作用，敲除了izumo基因的精子由于丧失了与卵子质膜融合的能力而使小鼠完全失去了生育能力。本研究通过应用基因免疫的原理及方法，研究了izumo基因在小鼠C57BL／6肌肉中的表达及对其生育能力的影响，为进一步研究人类和其他动物生育控制方法提供实验依据。【材料和方法】1)材料①重组质粒pCXN2-mizumo;②对照质粒pCXN2;③成熟雌性和雄性C57BL／6小鼠，6-8周龄;④抗血清，取自被免疫后的C57BL／6小鼠;⑤精子，取自成熟雄性C57BL／6小鼠附睾;⑥卵母细胞，取自经超排后的成熟雌性C57BL／6小鼠输卵管。2)方法①构建对照质粒pCXN2，用酶切法鉴定对照质粒是否构建成功;②重组质粒pCXN2-mizumo和对照质粒pCXN2 DNA的提取和纯化;③实验动物C57BL／6小鼠的免疫前预处理：每次免疫前用0.25％盐酸布比卡因多点注射实验动物左后腿胫前肌，提高DNA的摄取效率。3天后在同一部位进行DNA免疫;④实验动物C57BL／6小鼠的免疫：将实验动物随机分成两组，分别用重组质粒pCXN2-mizumo和对照质粒pCXN2免疫小鼠;⑤血清的制备：每次免疫前和最后一次免疫完成后2周从尾静脉取血制备血清;⑥RT—PCR检测pCXN2-mizumo在小鼠体内的表达;⑦ELISA法测定血清中抗izumo抗体的滴度;⑧体外受精（IVF）实验检测抗血清在体外的作用;⑨实验动物合笼后统计产仔数，分析免疫对小鼠生育能力的影响。说明对照质粒构建成功，重组质粒正确无误;②RT-PCR用1％的琼脂糖凝胶电泳得到RT-PCR产物为468bp，产物碱基测序结果经BLAST比对分析后证实为C57BL／6小鼠izumo的特异性mRNA片断，说明质粒pCXN2-mizumo在小鼠的体内可以表达;③ELISA检测重组质粒pCXN2-mizumo第一次免疫小鼠后2周即可检测到抗izumo特异性抗体，经过二次加强免疫后抗体水平从0～6周持续升高并维持在较高的水平;④体外受精试验实验组受精率为11.6％，对照组受精率为25.2％，统计分析表明差异有统计学意义，P＜0.05;⑤实验动物合笼免疫雌鼠与正常雄鼠交配，实验组与对照组间产仔数的差异具有统计学意义，P＜0.05;而免疫雄鼠与正常雌鼠交配，实验组与对照组的产仔数无统计学差异。【结论】①对照质粒pCXN2构建成功;②重组质粒pCXN2-mizumo可以在小鼠骨骼肌细胞中表达;③经重组质粒pCXN2-mizumo免疫的小鼠体内诱发了抗izumo特异性免疫应答。;④经重组质粒pCXN2-mizumo免疫后的小鼠抗血清在体外可以降低其受精率;⑤经重组质粒pCXN2-mizumo免疫的雌性小鼠的生育能力下降;⑥为izumo作为基因免疫避孕的靶抗原研究提供了新的实验证据。

关键词： izumo 免疫避孕基因免疫 C57BL/6小鼠

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哺乳动物精卵黏附和融合的分子基础

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生命的化学 2006年第5期26卷 392-395页

作者：段晓刚张红国刘睿智李晓影鲁郎芳东北师范大学遗传与细胞研究所长春130024 吉林大学基础医学院细胞生物学教研室长春130021

哺乳动物受精是一个多分子参与的多级过程,在精卵融合形成一个受精卵时达到顶点。新的研究已表明:精卵黏附后,精子膜从赤道区开始与卵膜融合;有精子膜上的去整合蛋白金属蛋白酶蛋白家族(ADAM)、izumo、附睾蛋白DE、卵膜上的整合蛋白、... 详细信息

哺乳动物受精是一个多分子参与的多级过程,在精卵融合形成一个受精卵时达到顶点。新的研究已表明:精卵黏附后,精子膜从赤道区开始与卵膜融合;有精子膜上的去整合蛋白金属蛋白酶蛋白家族(ADAM)、izumo、附睾蛋白DE、卵膜上的整合蛋白、四次跨膜蛋白CD9、CD81、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白等多种分子参与精卵黏附和融合过程。

关键词：精卵黏附和融合受精蛋白 izumo 四次跨膜蛋白CD9 糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白

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精卵融合过程中关键精子膜蛋白的研究进展

精卵融合过程中关键精子膜蛋白的研究进展

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中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会

作者：刘利敏陈德宇黄天华汕头大学医学院生殖医学研究中心阜阳师范学院生命科学院

受精是一个复杂的过程,其中精卵融合是受精过程的关键步骤。本文详细阐述精卵质膜融合过程中精子膜上相关蛋白成分,如:izumo 蛋白、ADAMs 基因家族蛋白、Crisp 基因家族蛋白的作用。其中 izumo 蛋白是2005年发现的与精卵融合相关的精子... 详细信息

受精是一个复杂的过程,其中精卵融合是受精过程的关键步骤。本文详细阐述精卵质膜融合过程中精子膜上相关蛋白成分,如:izumo 蛋白、ADAMs 基因家族蛋白、Crisp 基因家族蛋白的作用。其中 izumo 蛋白是2005年发现的与精卵融合相关的精子膜蛋白。izumo 基因敲除实验显示izumo-/-小鼠与对照组 izumo+/+无明显差异,只在生育力方面有差异,其中雌鼠有正常的生育能力,雄鼠却完全不育。受精素α、β和 Cytitestin 是 ADAMs 基因家族蛋白中主要成员,但受精素β-/-和 Cytitestin-/-的精卵质膜融合率达到正常精子的50%～70%。大鼠、小鼠酸性附睾糖蛋白-1(acidic epididymal glycoprotein,AEG-1)和人 ARP(AEG-related protein,ARP)蛋白是 Crisp 基因家族蛋白的主要成员,这三种蛋白的氨基酸序列具有较高的同源序列,而且存在较高保守性。大鼠蛋白 Crisp-1和人 ARP 的抗体处理后的精子可以明显降低受精率。这对于深入了解精卵融合的机制,提高临床上男性不育的诊治水平、以及新型避孕药物的研制具有现实意义。

关键词：精卵融合 izumo ADAMs Crisp

来源： cnki会议评论

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