重组小鼠精子蛋白Izumo的制备及其免疫避孕潜力的研究

作     者：王德刚 

作者单位：汕头大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄天华

授予年度：2007年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：Izumo 精卵融合 免疫避孕 精子抗原 亲和层析 

摘      要：【背景与目的】在众多的免疫避孕候选抗原中，精子抗原被认为是目前最有希望和最具应用前景的避孕疫苗靶抗原。2005年，一种新的精子特异表达的精卵融合关键蛋白Izumo的发现可能为避孕疫苗的研究提供了新思路和新材料。本课题旨在研究原核表达的重组小鼠Izumo(mlzumo)蛋白的免疫避孕潜力，为重组mlzumo蛋白是否能作为避孕疫苗候选靶抗原提供实验数据和科学依据。 【材料与方法】①构建pET28a(+)-mlzumo原核表达质粒;②在大肠杆菌中表达带有6His纯化标签的重组蛋白6His-mlzumo;③固化Ni亲和层析纯化重组蛋白6His-mIzumo，并透析复性和Bradford法定量;④通过腹腔注射用6His-mIzumo免疫雌雄性C57BL／6小鼠;⑤Western blot检测免疫小鼠血清抗6His-mlzumo IgG抗体的特异性;⑥ELISA检测血清特异性抗体滴度随免疫时间变化的规律;⑦精卵融合试验观察免疫血清对小鼠体外精卵融合的影响;⑧双荧光染色法对抗6His-mlzumo IgG抗体在精子上的识别部位进行定位;⑨免疫小鼠在末次免疫后第2周与正常小鼠合笼，评价其生育力。 【结果】①成功构建了pET28a(+)-mIzumo原核表达质粒;②成功表达和得到了纯化的重组蛋白6His-mlzumo;③雌性和雄性免疫小鼠体内都能产生血清特异性抗6His-mIzumoIgG抗体，特异性抗体与天然mlzumo存在交叉反应;④血清特异性抗6His-mIzumo IgG抗体开始出现在第一次加强免疫后第2周，末次免疫后第2周抗体滴度达到最高并至少持续到末次免疫后第6周;⑤6His-mlzumo免疫血清完全阻断小鼠体外精卵融合的发生;⑥抗6His-mlzumo IgG抗体特异地识别的小鼠AR精子(发生了顶体反应的精子)头部顶体区;⑦雌性和雄性免疫小鼠的生育力与PBS对照组相比没有明显降低。 【结论】通过pET原核表达系统成功制备带有6His纯化标签的重组蛋白6His-mlzumo：6His-mlzumo对于雌性和雄性小鼠都具有免疫原性;虽然免疫重组mlzumo蛋白能够使小鼠产生特异识别小鼠AR精子头部顶体区并能阻断体外精卵融合的血清特异性IgG抗体，但对雌性和雄性免疫小鼠生育力的影响不明显。因此，原核表达的重组mlzumo蛋白可能对免疫小鼠没有明显的避孕作用，Izumo是否能作为避孕疫苗研制的靶抗原还需要进一步的研究和探索。