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绵羊insl3基因组织表达规律与潜在功能位点分析研究

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 679-687页

作者：潘章源张自杰季久秀李华振孙安芳李富宽王慧储明星吕慎金临沂大学农林科学学院临沂276005 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室北京100193

旨在对绵羊insl3基因组织表达规律与潜在功能位点进行分析。本研究首先利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对健康、角型正常、1岁的小尾寒羊成年母羊和公羊各3只的insl3组织表达规律进行研究,随后利用10个品种重测序数据分析insl3基因区... 详细信息

旨在对绵羊insl3基因组织表达规律与潜在功能位点进行分析。本研究首先利用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术对健康、角型正常、1岁的小尾寒羊成年母羊和公羊各3只的insl3组织表达规律进行研究,随后利用10个品种重测序数据分析insl3基因区域主成分(PCA)和功能位点。定量结果显示,insl3基因在卵巢和睾丸中表达最高,在软角也表达,公羊睾丸表达量极显著高于母羊卵巢组织(P3位于ESR1结合位点,SNP6存在于终止子区域。同时还发现一个错义突变和同义突变。本研究表明,绵羊insl3基因可能既与公母羊角的差异有关,也可能与绵羊角的有无有关,并找到多个潜在功能位点,为今后研究其功能机制奠定基础。

关键词： insl3 实时荧光定量PCR 组织表达谱功能位点绵羊

β2肾上腺素受体激动剂克伦特罗对睾丸间质细胞与脂肪细胞共培养体系中睾丸间质细胞insl3及3β-HSD的表达效应

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β2肾上腺素受体激动剂克伦特罗对睾丸间质细胞与脂肪细胞共培养...

作者：杨海婷暨南大学

学位级别：硕士

目的1.应用3T3-L1脂肪细胞体外培养体系,探讨克伦特罗(clenbuterol, CLB),莱克多巴胺(ractopamine, RAC)和齐帕特罗(zilpaterol, ZIL)对脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activated receptor γ, PPARγ)及脂联素(adiponectin, ADP)表达的影响及差异,阐明CLB, RAC, ZIL引起脂肪细胞内分泌紊乱的分子机制,以及三者对脂肪内分泌紊乱相关性生殖疾病潜在的影响。2.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型,探讨成熟脂肪细胞对睾丸间质细胞胰岛素样因子(Insulin-like factor, insl3)及3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)的表达效应,有助于阐明肥胖诱导男性不育症的分子机制。3.建立脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养模型,探讨CLB对共培养体系中睾丸间质细胞insl3及3β-HSD表达的影响,阐明CLB在脂肪内分泌紊乱相关性男性生殖疾病中可能介导的环节。材料与方法1.材料1.1 3T3-L1脂肪细胞3T3-L1前脂肪细胞株购自于中国科学院上海细胞库,定向诱导为3T3-L1成熟脂肪细胞后进行实验。1.2 TM3睾丸间质细胞TM3睾丸间质细胞由暨南大学禹艳红老师惠赠,培养传代后可进行实验。2.实验分组及给药2.1 3T3-L1脂肪细胞分组及给药本项实验添加不同剂量的药物培养12h,24h后分别收集细胞,进行细胞活性与PPARγ及ADP表达水平的检测。本项实验分组见表1。2.2共培养体系分组及给药将睾丸间质细胞分别与成熟脂肪细胞,添加5μM CLB处理的成熟脂肪细胞共培养48小时,分别标记为脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组,CLB处理脂肪细胞与睾丸间质细胞共培养组;另添加5μM CLB处理睾丸间质细胞单独培养,标记为CLB处理睾丸间质细胞实验组;将单独培养的睾丸间质细胞设为对照组。3.实验方法3.1 3T3-L1前脂肪细胞诱导及鉴定3T3-L1前脂肪细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养液在37℃,5%CO2条件培养。待细胞贴壁,生长至接触抑制后2天进行成脂诱导分化,更换含有0.5mM IBMX、10μg/ml胰岛素和1μM地塞米松的诱导剂及10% FBS的DMEM高糖培养液。2天后,更换只含10μg/ml胰岛素及10%FBS的培养液继续培养,每2天换液1次。8-10天后,90%的细胞内出现脂滴,可用于后续实验。油红O染色鉴定成熟脂肪细胞。3.2 TM3睾丸间质细胞的培养TM3睾丸间质细胞用含10%马血清的DMEM/F12培养液,在37℃,5% C02培养箱培养,每2天换液1次,直至细胞融合达80%以上,可进行传代。3.3共培养体系的建立采用Transwell系统进行3T3-L1脂肪细胞和TM3睾丸间质细胞共培养。3T3-L1脂肪细胞种入6孔培养板,经诱导后,在Transwell小室种入TM3睾丸间质细胞。在37℃,5% CO2培养箱中培养48小时。3.4 3T3-L1脂肪细胞活性检测MTT分别检测不同剂量CLB, RAC,ZIL对3T3-L1脂肪细胞活性的影响。3.5脂肪因子PPARγ及ADP,睾丸间质细胞insl3及3β-HSD的表达RT-PCR和Western blot检测脂肪因子PPARγ、ADP,睾丸间质细胞insl3、 3β-HSD表达水平的变化。4.统计学方法数据以平均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS21.0统计学软件进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA),有统计学意义则用Tukey法作组间均数的两两比较。以P3T3-L1脂肪细胞诱导及鉴定3T3-L1前脂肪细胞生长接触抑制后,经诱导8-10天,3T3-L1前脂肪细胞可分化为成熟脂肪细胞。并经油红O染色鉴定,大约90%的3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。2. CLB,ZIL,RAC对3T3-L1脂肪细胞活性的影响及差异与对照组相比,CLB,RAC,ZIL分别处理12h和24h后各剂量组细胞活性均呈下降趋势,剂量越大,活性影响越大,差异显著(P<0.05)。培养12h,细胞活性：B组

关键词：克伦特罗(CLB) 莱克多巴胺(RAC) 齐帕特罗(ZIL) 脂肪细胞 PPARγ 脂联素(ADP) 睾丸间质细胞 insl3 3β-HSD

初生及35日龄滩羊睾丸组织化学特征及insl3表达比较

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甘肃农业大学学报 2022年第6期57卷 10-18页

作者：陈少宇袁莉刚杨洪早陶金忠丁伟甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 宁夏大学农学院宁夏银川750021 宁夏农林科学院动物科学研究所宁夏银川750021

【目的】研究胰岛素样因子3(Insulin-like factor 3,insl3)对滩羊睾丸发育及生殖机能调节的影响。【方法】采用睾丸摘除手术收集初生及35日龄滩羊睾丸,应用特殊染色,免疫组织化学及免疫荧光技术方法结合形态计量学统计软件,比较初生与3... 详细信息

【目的】研究胰岛素样因子3(Insulin-like factor 3,insl3)对滩羊睾丸发育及生殖机能调节的影响。【方法】采用睾丸摘除手术收集初生及35日龄滩羊睾丸,应用特殊染色,免疫组织化学及免疫荧光技术方法结合形态计量学统计软件,比较初生与35日龄滩羊睾丸的组织化学特点,分析滩羊睾丸组织化学特点及发育规律。【结果】相较于初生滩羊,35日龄滩羊睾丸组织发育,AB染色在生精小管基膜阳性反应增强;生殖母细胞PAS染色阳性反应明显,间质组织胶原纤维增加。免疫组化及免疫荧光结果表明,35日龄滩羊睾丸组织中insl3在生殖母细胞、Sertoli细胞及管周肌样细胞中表达较初生滩羊有所减弱;在Leydig细胞中表达下降。【结论】滩羊初生至35日龄睾丸发育过程中,酸性糖类物质代谢优于其他糖类成分,网状纤维生成早于胶原纤维。insl3对睾丸生精细胞无明显调节作用;其表达降低与Leydig细胞中FLCs细胞群逐渐减少相一致。本研究为insl3对Leydig细胞分泌功能调控机制的研究提供了参考。

关键词：滩羊 insl3 日龄睾丸 Leydig细胞

浅谈人类蛋白图谱数据库在《组织学》教学中应用——以睾丸间质细胞标记物insl3为例

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包头医学院学报 2022年第8期38卷 79-81,86页

作者：卜文超陈世新曹明国边维丽水学院医学院浙江丽水323000

目的:探讨人类蛋白图谱数据库在《组织学》教学中的应用效果。方法:通过检索人类蛋白数据库,利用细胞特异性标志物定位特定组织中目标细胞,使抽象的细胞更加精确定位。结果:本文以睾丸间质细胞特异标志物insl3为例,应用人类蛋白图谱数... 详细信息

目的:探讨人类蛋白图谱数据库在《组织学》教学中的应用效果。方法:通过检索人类蛋白数据库,利用细胞特异性标志物定位特定组织中目标细胞,使抽象的细胞更加精确定位。结果:本文以睾丸间质细胞特异标志物insl3为例,应用人类蛋白图谱数据库检索经过insl3标记的睾丸间质细胞,达到定位睾丸间质细胞的目的,以区分周围组织中其他类型细胞。结论:人类蛋白图谱数据库有望广泛应用于《组织学》教学中,为定位目的细胞提供良好的范例,使《组织学》中抽象的目的细胞形象化。

关键词： HPA数据库 insl3 睾丸间质细胞组织学教学

Brief maternal exposure of rats to the xenobiotics dibutyl phthalate or diethylstilbestrol alters adult-type Leydig cell development in male offspring

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Asian Journal of Andrology 2013年第2期15卷 261-268,I0009页

作者： Richard Ivell Kee Heng Helen Nicholson Ravinder Anand-Ivell School of Molecular and Biomedical Science University of Adelaide Adelaide 5005 Australia FBN Leibniz Institute of Farm Animal Biology Dummerstorf 18196 Germany Centre for Reproduction and Genomics Otago School of Medical Sciences University of Otago Dunedin 9054 New Zealand School of Pharmacy and Medical Sciences University of South Australia Adelaide 5000 Australia

Maternal exposure to estrogenic xenobiotics or phthalates has been implicated in the distortion of early male reproductive development, referred to in humans as the testicular dysgenesis syndrome. It is not known, however, whether such early gestational and/or lactational exposure can influence the later adult-type Leydig cell phenotype. In this study, Sprague-Dawley rats were exposed to dibutyl phthalate （DBP; from gestational day （GD） 14.5 to postnatal day （PND） 6） or diethylstilbestrol （DES; from GD14o5 to GD16.5） during a short gestationalllactational window, and male offspring subsequently analysed for various postnatal testicular parameters. All offspring remained in good health throughout the study. Maternal xenobiotic treatment appeared to modify specific Leydig cell gene expression in male offspring, particularly during the dynamic phase of mid-puberty, with serum insl3 concentrations showing that these compounds led to a faster attainment of peak values, and a modest acceleration of the pubertal trajectory. Part of this effect appeared to be due to a treatment-specific impact on Leydig cell proliferation during puberty for both xenobiotics. Taken together, these results support the notion that maternal exposure to certain xenobiotics can also influence the development of the adult-type Leydig cell population, possibly through an effect on the Leydig stem cell population.

关键词： diethylstilbestrol (DES) insl3 Leydig cells dibutyl phthalate (DBP) puberty testis

胰岛素样因子3对培养小鼠睾丸引带细胞的影响

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胰岛素样因子3对培养小鼠睾丸引带细胞的影响

作者：祁艳卫汕头大学

学位级别：硕士

目的: 许多研究表明,男性生殖系统分化和发育异常明显增加,大多数与睾丸发育、下降不全相关,而睾丸引带与睾丸发育、下降关系密切。人类胰岛素样因子3(insl3)基因广泛存在,其表达的蛋白多肽是胰岛素样家族激素的一部分,是睾丸经腹下降... 详细信息

目的: 许多研究表明,男性生殖系统分化和发育异常明显增加,大多数与睾丸发育、下降不全相关,而睾丸引带与睾丸发育、下降关系密切。人类胰岛素样因子3(insl3)基因广泛存在,其表达的蛋白多肽是胰岛素样家族激素的一部分,是睾丸经腹下降阶段的主要调节激素,对睾丸引带的发育起决定性作用。但到目前为止,关于insl3影响睾丸引带发育的机制尚未研究清楚。本实验拟通过体外培养小鼠睾丸引带细胞,利用不同浓度insl3直接作用于培养的小鼠睾丸引带细胞,研究insl3对培养小鼠睾丸引带细胞增殖和收缩活性的影响,以探讨insl3影响睾丸下降的可能机理。方法: 脱颈椎处死3d大雄性昆明小鼠,消毒后正中剪开下腹部,再次辨认雌雄,在3倍手术放大镜下于膀胱两侧完整游离出睾丸、附睾及睾丸引带,置于PBS中剔出大部分睾丸引带组织。将引带组织放入含Ⅰ型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养液中,37℃持续震荡消化1小时后,加入3-4倍含无雌激素血清的培养液终止消化作用,1500r/min离心滤液5min,弃上清。将细胞沉淀加入含无雌激素胎牛血清(10%v/v)DMEM培养基,接种于25cm培养瓶中,置于5% CO、37℃饱和湿度孵育箱中静置培养。根据不同的检测要求,将贴壁的睾丸引带细胞以6×10/ml密度的细胞悬液(Ⅰ代细胞或者Ⅱ代细胞)分别传代接种到6孔板、96孔板以及培养瓶中,并用台盼蓝染色计数法确定细胞存活率,血清浓度为5%培养。细胞接种约24小时后,随机分为实验组(insl3 0.02ng/ml、0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml)、正常对照组细胞。加药后,insl3作用不同时间获取标本,分别采用HE染色、CCK-8、免疫荧光以及流式细胞分析术等方法检测小鼠睾丸引带细胞增殖以及F-actin的表达情况。结果: 1.原代培养的小鼠睾丸引带细胞大部分为成纤维样细胞,有少数上皮样细胞生长,呈放射状、火焰状或漩涡状走行,胞体呈梭形、不规则形或三角形,胞质有突起。传代后细胞仍呈成纤维细胞型生长,同源性好,存活率约为90%。 2. CCK-8方法发现正常对照组细胞呈持续性增殖,于培养24h后增殖越趋明显。与正常对照组增殖趋势类似,实验组加药后12h即存在增殖(P0.05),48h出现明显差异(P0.05),而24h与48h情况则不同:24h时2.00ng/ml、20.00ng/ml组与正常对照组相比均有差异(P0.05)。 3.免疫荧光显示正常对照组的F-actin主要分布在细胞周边,形成周边肌动蛋白丝带,胞浆内可见少量短而细的应力纤维。insl3刺激引起细胞骨架重塑,细胞周边肌动蛋白丝带增多,且胞浆中微丝F-actin明显粗大、变长,大多为较长的粗大应力丝,沿细胞纵轴排列较多。在20.00ng/ml组变化尤其明显,呈一定的剂量和时间相关性。 4.流式细胞仪检测F-actin蛋白显示insl3作用24h后0.02ng/ml、0.20ng/ml组平均荧光强度与正常对照组相比有所下降,均有统计学差异(P0.05),20.00ng/ml组平均荧光强度明显高于正常对照组(P0.05),而0.20ng/ml、2.00ng/ml、20.00ng/ml组均有差异(Pinsl3对小鼠睾丸引带细胞增殖有显著的促进作用,呈剂量-时间效应。 3. F-actin的检测结果从形态学以及蛋白定量分析方面均提示insl3可能通过增强小鼠睾丸引带细胞的收缩来影响睾丸引带的发育,进而影响睾丸的正常下降。

关键词： insl3 睾丸引带睾丸引带细胞培养 CCK-8 F-肌动蛋白(F-actin) 流式细胞术

环境雌激素致雄性生殖系统发育异常途径的研究进展

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生殖医学杂志 2008年第2期17卷 151-155页

作者：张升敏蒋学武汕头大学第二附属医院小儿外科广东汕头515031

大量动物实验表明环境雌激素(EEs)具有生殖和(或)发育毒性,其致雄性生殖系统发育畸形的机制复杂,尤其作用途径目前仍很不明了。本文从EEs干扰睾丸发育、影响睾丸激素产生、代谢并进而致雄性生殖系统发育畸形的可能途径介绍近年来国内外... 详细信息

大量动物实验表明环境雌激素(EEs)具有生殖和(或)发育毒性,其致雄性生殖系统发育畸形的机制复杂,尤其作用途径目前仍很不明了。本文从EEs干扰睾丸发育、影响睾丸激素产生、代谢并进而致雄性生殖系统发育畸形的可能途径介绍近年来国内外取得的进展。

关键词：环境雌激素雄性生殖系统发育异常睾酮 insl3 Sertoli细胞 Leydig细胞