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巨核酸酶i-scei转基因元件的构建及其在斑马鱼中转基因效率的评估

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上海海洋大学学报 2015年第5期24卷 650-655页

作者：孙成飞董浚键田园园余嘉欣叶星中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

巨核酸酶i-scei是由酿酒酵母线粒体中核糖体大亚基上的Ⅰ型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。i-scei介导的转基因大多是将i-scei蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且... 详细信息

巨核酸酶i-scei是由酿酒酵母线粒体中核糖体大亚基上的Ⅰ型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。i-scei介导的转基因大多是将i-scei蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且工作量大,直接用i-scei的mR NA代替蛋白进行注射更为简捷。本研究应用i-scei mR NA介导荧光蛋白基因在斑马鱼中的转植,进一步了解其转基因效率。首先设计合成带有巨核酸酶i-scei编码序列的辅助质粒(pC S2-i-scei),并分别构建了带有巨核酸酶i-scei识别位点、EF1α启动子和荧光蛋白基因(eG FP/RFP)编码序列的供体质粒pi-scei-EF1α-eG FP/RFP。辅助质粒pC S2-i-scei体外转录成mR NA,以50 ng/μL供体质粒和100 ng/μL的i-scei巨核酸酶mR NA共注射到斑马鱼(Danio rerio)受精卵中,注射后48 h的斑马鱼eG FP的平均荧光表达率可达75.86%。在斑马鱼的头部、躯干到尾部均可观察到荧光蛋白的表达,且随着胚胎发育,荧光信号逐渐增强。结果表明i-scei系统在斑马鱼中可介导较高效率的转植,具有在经济鱼类转基因研究中应用的潜力。

关键词：巨核酸酶 i-scei 斑马鱼转基因

重组限制性内切酶i-scei在毕赤酵母GS115中的表达与酶活性质研究

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重组限制性内切酶I-SceI在毕赤酵母GS115中的表达与酶活性质研究

作者：邓璇湖北大学

学位级别：硕士

i-Scel是一种由内含子编码的归位内切酶,该内含子存在于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的线粒体中。内含子编码的内切酶是能够促使内含子在DNA水平上进行转移第一步的酶。它们识别和剪切同源等位基因的非内含子区域,然后通过双链... 详细信息

i-Scel是一种由内含子编码的归位内切酶,该内含子存在于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的线粒体中。内含子编码的内切酶是能够促使内含子在DNA水平上进行转移第一步的酶。它们识别和剪切同源等位基因的非内含子区域,然后通过双链剪切修复机制插入内含子,这样可以使受体等位基因也具有内含子。由于i-scei具有的这些特点,在高分辨率的物理图谱,基因组组织分析,基因克隆和定点重组诱导,还有在多种多样的生物系统中双链突变修复的研究中,这种酶都能成为很有利的工具。目前商品化的i-scei都是在大肠杆菌中诱导表达的,但是表达量不高,而且后续纯化步骤复杂。为了提高i-scei的表达量,我们利用了外源蛋白表达量高,自身分泌表达蛋白少,易于分离纯化外源蛋白,便于高密度发酵的巴斯德毕赤酵母表达系统实现了i-scei的分泌表达。首先我们合成了i-scei基因(708bp),然后将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905A中,重组质粒经内切酶Sali线性化并用电转的方法转化毕到赤酵母菌株GS115中。经MD平板筛选和PCR鉴定出正确的转化子。对携带有i-scei基因的重组GS115菌株进行摇瓶培养,经甲醇诱导后,收集上清,并对其进行SDS-PAGE分析,结果显示,该蛋白获得表达,表达量约为179mg/L。进一步的实验表明i-scei能特异性的切割质粒Fast-spec上的两个i-scei识别位点,证明重组i-scei蛋白具有生物活性,而且i-scei在毕赤酵母中成功表达。同时,我们将i-scei的ORF与从来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7d基因的ORF进行N端和C端融合,并利用巴斯德毕赤表达系统对两种融合蛋白进行了表达。两种蛋白都已获得成功表达,并且能够专一性识别Fast-spec质粒上的i-scei位点,证明这两种蛋白都具有生物活性。更为重要的是融合Sso7d的i-scei具有更高的切割效率。这可能是由于Sso7d改变了DNA的空间结构,从而使得i-scei更容易作用于DNA上特异性位点。在进一步的工作中,我们拟进一步筛选高表达的Sso7d与i-scei融合蛋白的毕赤酵母菌株,从而应用于工业生产中。

关键词：限制性内切酶 i-scei Sso7d 嗜热菌巴斯德毕赤酵母表达

OsbZiP81水稻转基因植株的构建和限制性内切酶i-scei的制备

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OsbZIP81水稻转基因植株的构建和限制性内切酶I-SceI的制备

作者：施少鹏华中农业大学

学位级别：硕士

本论文主要分成两个部分:1.水稻OsbZiP81转基因材料的构建及其与OsiMPa4相互作用的初步探究;2.限制性内切酶i-scei的制备。农杆菌介导的水稻遗传转化,能将包含外源基因的T-DNA整合到水稻基因组中,并能稳定遗传。研究表明拟南芥基因AtiM... 详细信息

本论文主要分成两个部分:1.水稻OsbZiP81转基因材料的构建及其与OsiMPa4相互作用的初步探究;2.限制性内切酶i-scei的制备。农杆菌介导的水稻遗传转化,能将包含外源基因的T-DNA整合到水稻基因组中,并能稳定遗传。研究表明拟南芥基因AtiMPa4在T-DNA复合物入核,AtViP1在T-DNA整合到基因组的过程中都发挥重要的作用,同时AtViP1作为拟南芥bZiP转录因子能调控下游基因响应非生物胁迫。本研究对AtViP1在水稻中的同源基因OsbZiP81展开了初步研究,结果如下:***81属于水稻bZiP转录因子第iX亚家族的基因,有三个转录本。通过同源比对AtViP1与水稻bZiP第iX亚家族的基因,发现它们的bZiP结构域都很保守,同时OsbZiP81与AtViP1具有很高的氨基酸序列相似度。2.构建了OsbZiP81的超表达与CRiSPR敲除的转基因水稻植株,发现在超表达转基因植株中OsbZiP81表达量明显高于野生型,在CRiSPR敲除转基因植株中OsbZiP81的表达量则显著降低。***4是AtiMPa4在水稻内的同源基因,酵母双杂交以及BiFC结果显示OsiMPa4与OsbZiP81的三个转录本蛋白都能相互作用。限制性内切酶是分子生物学中一种非常重要的工具酶。i-scei是酿酒酵母线粒体内含子编码的一种限制性内切酶,它的识别位点为18个碱基的非回文序列,酶切后产生不对称的粘性末端,并且在动植物基因组中不含或只含有极少的酶切位点。因此i-Sce i适用于BAC文库中大片段外源DNA的酶切检测和不同载体之间大片段外源DNA的交换。本研究通过基因合成、克隆、表达、纯化获得重组蛋白GST-i-scei,测得蛋白浓度是590 mg/L,通过酶切质粒验证得到GST-i-scei蛋白酶活是0.2 U/μL,GST-i-scei比活约为340 U/mg。

关键词：水稻 OsbZiP81 遗传转化 OsiMPa4 i-scei

N-乙酰-D-神经氨酸酶全细胞催化和i-scei介导的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组修饰

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N-乙酰-D-神经氨酸酶全细胞催化和I-SceI介导的谷氨酸棒状杆菌ATC...

作者：高欣悦南京师范大学

学位级别：硕士

N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)是一种天然存在的碳水化合物,附着在细胞表面和可溶性蛋白质上的糖链末端。Neu5Ac是合成抗流感药物扎那米韦的前体,具有重要的生物学功能和医药价值。全细胞催化合成Neu5Ac的方法因其操作简便,成本低廉等优点... 详细信息

N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)是一种天然存在的碳水化合物,附着在细胞表面和可溶性蛋白质上的糖链末端。Neu5Ac是合成抗流感药物扎那米韦的前体,具有重要的生物学功能和医药价值。全细胞催化合成Neu5Ac的方法因其操作简便,成本低廉等优点,目前被认为是最适合合成Neu5Ac的方法。为探索Neu5Ac全细胞催化工艺,我们首先选取了5种不同的异构酶基因克隆到表达载体pET30a(+)上异源表达,摸索表达条件,选出质粒pLS3704A,其上克隆了来源于人肠道细菌Bacteroides thetaiotaomicron VPi-5482的异构酶基因BT0453,SDS-PAGE显示BT0453约有50%的可溶性,超过其他的蛋白。我们还尝试了在阿拉伯糖、鼠李糖表达系统中表达BT0453,但表达效果不理想。大肠杆菌来源的醛缩酶NanA几乎全部可溶。其次,将BT0453与nanA融合克隆到同一质粒中,得到pLS3706A。为了将BT0453和nanA敲入至基因组中,我们采用了重组工程和i-scei介导的双链断裂修复的方法,构建了质粒pLS3724,并最终获得了BT0453及nanA基因组敲入菌株LS3702。第三,将有利于Neu5Ac生成的基因glmS*72整合到基因组上同时将nagABE基因敲除得到了菌株LS3704,将ScGNA1基因整合到基因组中同时敲除manXYZ基因得到菌株LS3706,将另外一个拷贝的ScGNA1基因再次整合到基因组上同时将fuciK基因敲除得到了菌株LS3708。在以上工作的基础上将双质粒系统pLS3704A、pLS3705A,单质粒系统pLS3706A、基因组系统LS2402、LS3702,和基因整合菌株LS3704、LS3706、LS3708,以GlcNAc和丙酮酸钠为底物,全细胞催化生成Neu5Ac,结果双质粒系统pLS3704A偶联pLS3705A最大摩尔转化率可达到50.2%,基因组敲入菌株LS3702转化的最快,摩尔转化率最高达到47.6%,单质粒pLS3706A和基因组敲入菌株LS2402的摩尔转化率为47.7%。但LS3704、LS3706、LS3708未能催化出Neu5Ac。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌株是重要的用于生产氨基酸及其衍生物的工业菌株,对其基因组的改造将有助于研究基因表征和蛋白质功能,但是目前的基因组改造策略仍存在效率以及操作繁琐低等问题,通过归巢内切酶i-SceⅠ介导的基因敲除可能简化操作。通过设计引物,PCR扩增得到同源臂,克隆到T载体,再将同源片段连接到自杀质粒载体上,最终得到敲除crt操纵元的质粒pLS3726,基因敲除CGP1的质粒pLS3728,敲除CGP2的质粒pLS3730,敲除CGP3的质粒pLS3732以及dkan敲入质粒pLS3735。重组后通过抗性筛选得到正确的整合菌株,整合菌株只需加入iPTG诱导,筛选所得无抗菌株,再通过PCR和测序验证即可筛选出目的菌株,无需通过SacB等改变培养基的方法进行筛选。实验结果最终得到敲除crt操纵元的菌株LS3752,敲除CGP1的菌株LS3754,dkan敲入菌株LS3760,CGP2和CGP3的基因敲除仍在进行之中。以LS3760为基础,比较寡核苷酸前导链和滞后链对dkan恢复为kan的点突变的效率,结果显示滞后链效率高于前导链。我们还发现寡核苷酸的量与重组效率呈正相关。在寡核苷酸的5’端含4个磷硫酰连接和寡核苷酸多个位点突变方面也做了初步尝试,但最后多个位点的突变得到的菌株测序发现有错误的突变。

关键词： N-乙酰-D-神经氨酸 BT0453 全细胞催化谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 i-scei 重组工程基因组修饰

通过归位内切酶引起的donor质粒胞内线性化可提高TALEN介导的同源重组效率

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江西科学 2015年第3期33卷 343-346,390页

作者：朱向莹王庆亮吴庆沈强季国庆上海市吉凯基因化学技术有限公司上海201203

TALEN是一种常用的细胞基因组修饰工具。然而,目前TALEN技术介导的基因敲入效率较低,对提高TALEN介导基因敲入效率的方法进行了摸索。通过在Donor质粒引入Ⅰ-SceⅠ酶切位点,并将Donor质粒、表达Ⅰ-SceⅠ的质粒及TALEN质粒对共转染,引发D... 详细信息

TALEN是一种常用的细胞基因组修饰工具。然而,目前TALEN技术介导的基因敲入效率较低,对提高TALEN介导基因敲入效率的方法进行了摸索。通过在Donor质粒引入Ⅰ-SceⅠ酶切位点,并将Donor质粒、表达Ⅰ-SceⅠ的质粒及TALEN质粒对共转染,引发Donor质粒细胞内线性化。在以基因PC为靶位点时,经Ⅰ-SceⅠ胞内线性化的donor质粒基因成功定点插入的效率比不经过Ⅰ-SceⅠ胞内线性化的质粒提高300%。在另一个基因BSG的TALEN基因敲入系统中,这一效率提高200%。结果表明,Ⅰ-SceⅠ介导的donor质粒胞内线性化可提高TALEN knock in系统的同源重组效率。

关键词： TALEN 线性化 i-scei

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大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

中国生物工程杂志 2014年第6期34卷 68-74页

作者：葛高顺张立超赵昕胡学军李雅杰大连大学医学院大连116622 辽宁出入境检验检疫局大连116001

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶i-scei的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,... 详细信息

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶i-scei的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆i-scei表达的诱导剂浓度。通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线,研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果:成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,并在无痕化处理时,通过延长与基因组同源DNA的长度,由通常使用的80碱基对延长到684碱基对;并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度,由500μg/ml提高到1000μg/ml后,使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明,缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论:通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。

关键词：大肠杆菌基因组无痕敲除 Red同源重组系统 i-scei

谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除和重组工程介导的点突变方法的探索

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谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除和重组工程介导的点突变方法的...

作者：徐燕南京师范大学

学位级别：硕士

基因重组是可用于基因克隆、基因修饰的一种分子生物学技术,操作简单而高效,对于基因表征的研究具有重要的价值和意义。本论文主要研究谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因敲除和重组工程介导的点突变。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌... 详细信息

基因重组是可用于基因克隆、基因修饰的一种分子生物学技术,操作简单而高效,对于基因表征的研究具有重要的价值和意义。本论文主要研究谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因敲除和重组工程介导的点突变。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032及其衍生菌株是工业上用于生产氨基酸的重要生产菌株。染色体基因敲除的研究将有助于研究基因表征和蛋白质功能。为克服目前的方法效率低的问题,探索比较各系统的敲除效率,以期建立一个适用于谷氨酸棒状杆菌的高效简便基因编辑方法。首先,通过调节i-scei基因之前的核糖体结合位点获得更高水平的基因表达。尽管打靶DNA片段通过重组工程成功替代了抗性基因,但第二步抗性基因的去除未能通过短同源臂介导的重组而实现。将同源臂延伸至1 kb后,由自杀载体介导的基因敲除成功实现了无痕敲除。高敲除效率显示了此法具有作为有效基因敲除策略的强大潜力。通过构建Cre诱导型表达载体和crti2基因缺失载体,初步测试了另一种基因敲除系统——Cre/loxP介导的基因敲除系统。最后,构建了 iPTG诱导的recT-cas9基因表达载体,将用于单链DNA辅助的CRiSPR/Cas9介导的染色体基因编辑。本论文的第二部分是重组介导的基因点突变的研究。选择N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因nanA进行S208G和E192饱和诱导突变实验。将含有nanA基因的质粒pLS122和突变DNA片段共转化到重组工程的大肠杆菌细胞中诱使核苷酸发生突变。通过调整pLS122与突变DNA片段的摩尔比为1:1后,5位点的S208G突变效率从44.2%增加至79.73%。E192的饱和诱导突变,成功获得了 19种氨基酸;但通过许多试验无法获得天冬酰胺,表明该方法的局限性。同时我们发现同源臂的长度对突变效率没有明显的影响,而基于染色体的重组系统更适合点突变。需要进一步改进才能使重组工程介导的点突变成为一种稳健可行的基因修饰策略。

关键词：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 基因敲除 i-scei Cre/loxP系统重组工程点突变

谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除方法学的研究

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谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032基因敲除方法学的研究

作者：吴梦南京师范大学

学位级别：硕士

基因敲除是阐明基因功能与构建高效微生物细胞工厂的重要手段。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是工业上重要的用于生产氨基酸及其衍生物的菌株。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032（*** ATCC 13032）为模式菌株,对该菌株基因组... 详细信息

基因敲除是阐明基因功能与构建高效微生物细胞工厂的重要手段。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）是工业上重要的用于生产氨基酸及其衍生物的菌株。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032（*** ATCC 13032）为模式菌株,对该菌株基因组的修饰将有助于研究基因表征,蛋白质功能,并有助于提高氨基酸的产量及优化氨基酸的生产工艺。R6K复制子的复制需要一种特殊的Pir蛋白,大多数细菌不产生这种蛋白质,因此R6K复制子广泛地用于自杀质粒的构建。自杀质粒转化至寄主细胞后须整合到染色体上与染色体一同复制。根据这个特点,可以利用目标敲除基因两端的同源片段,定位自杀质粒的整合位点,从而构建精确的基因缺失菌株。目前对于*** ATCC 13032的基因改造策略仍存在操作繁琐及效率低等缺点。为研究此问题,本研究组此前利用自杀质粒与i-scei联合介导的基因工程策略得到了一系列将自杀质粒整合至*** ATCC 13032染色体基因组上的整合菌株。本文第一部分首先对于这些整合菌株进行自杀质粒的消除。随后对*** ATCC 13032基因组中的2个前噬菌体即CGP2和CGP3进行敲除。具体方法为构建自杀质粒pLS3730和pLS3732,分别转入*** ATCC 13032,获得具有卡那霉素抗性的整合菌株,随后在含1 mM iPTG的液体培养基中进行培养,iPTG诱导归巢核酸内切酶i-scei表达,通过酶切整合菌株染色体上的i-scei酶切位点造成菌株染色体DNA的双链断裂,菌株在自身的修复机制下进行同源重组,得到crti2、crt操纵元、CGP1、CGP2的无痕敲除菌株。实验结果表明,基因敲除的效率均高于50%,最高达到90%。在以自杀质粒进行前噬菌体CGP3的基因敲除实验发现,用此方法只得到将自杀质粒整合至基因组的菌株,并未得到正确的敲除菌株。推测可能是由于CGP3长达180kb而不利于双链断裂修复的进行。为探索高效敲除*** ATCC 13032基因组中CGP3的方法,本研究第二部分分别通过基于质粒水平和基因组水平联合重组工程和i-scei的方法对CGP3进行敲除。重组工程,即重组介导的基因工程,也称作λ-Red/ET同源重组,是一种通过表达重组酶来催化DNA分子之间进行同源重组而实现DNA修饰的一种基因工程手段。其中发挥作用的重组酶,主要是由λ噬菌体中redαβ基因表达的蛋白或由大肠杆菌Rac前噬菌体中的recET基因表达的蛋白。重组工程的突出优点在于该技术实验过程操作简单,不受DNA分子大小及限制性内切酶酶切位点的限制,避免了其他基因敲除方法中需要反复构建克隆的步骤,直接通过PCR或OE-PCR即可获得重组片段,实现对基因组的精准修饰。重组工程和i-scei联合介导的基因敲除,具体方法为构建含有CGP3敲除的打靶DNA片段的质粒pLS4121,以及表达重组酶及归巢核酸内切酶i-scei不同诱导体系的质粒 pLS3635、pLS4132、pLS4133、pLS4136、pLS4137。将质粒分别转入*** ATCC 13032中,得到含有能够诱导表达重组酶质粒的菌株。构建能够将诱导表达重组酶及i-scei的DNA元件整合至基因组的质粒pLS4141,将其转入谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032中得到基因组水平表达重组酶及i-scei的菌株LS4129。再向这些菌株中转入打靶DNA片段,通过抗性筛选获得打靶DNA片段整合至基因组上的菌株,利用不同的诱导体系诱导表达i-scei,最终得到CGP3无痕敲除菌株。结果显示利用由iPTG诱导表达重组酶基因recET,L-阿拉伯糖诱导表达密码子修饰的i-scei的质粒pLS4132敲除CGP3的效率最高,且打靶DNA片段上的同源臂长度达到1 kb时敲除效果最佳。本研究虽然能够实现基因敲除,但目前的基因敲除效率仍然较低,后续的实验将优化各条件以提高其效率。

关键词：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 自杀质粒重组工程 i-scei 基因组修饰无痕敲除

人类akirin的功能研究及利用CRiSPR-CAS9介导斑马鱼性成熟相关基因的诱变与筛选

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人类akirin的功能研究及利用CRISPR-CAS9介导斑马鱼性成熟相关基...

作者：孔雨山东大学

学位级别：硕士

Akirin是一个在昆虫和脊椎动物中都高度保守的核内蛋白,参与到天然免疫调控过程中。在昆虫等无脊椎动物基因组中只有一个akirin基因,而在脊椎动物的基因组中发生了akiri基因的倍增,出现了两个akirin家族成员(akirin1和akirin2),并且发... 详细信息

Akirin是一个在昆虫和脊椎动物中都高度保守的核内蛋白,参与到天然免疫调控过程中。在昆虫等无脊椎动物基因组中只有一个akirin基因,而在脊椎动物的基因组中发生了akiri基因的倍增,出现了两个akirin家族成员(akirin1和akirin2),并且发生了功能上的分化。其中,无脊椎动物的akirin与脊椎动物的akirin2同源性更高。有研究表明,无脊椎动物akirin和脊椎动物akirin2能够参与机体的免疫防御过程,并作为核内转录因子协助NF-κB(nuclear transcription factor kappa B)调节下游靶基因的表达,进而对机体的重要生理过程进行调控,但是其调节的机制知之甚少。本部分选取人类akirin2基因作为研究对象,利用多种分子生物学和细胞生物学手段,在人源细胞系中开展人源akirin2参与NF-κB信号通路调节机制的研究,初步探究人类akirin2基因的表达模式和功能。我们克隆得到人类akirin2,命名为human akirin2。该序列编码203个氨基酸,有两个入核信号(nuclear localization signal,NLS)和1个与14-3-3蛋白相结合的位点,除此之外,该蛋白不再具有其它已知功能域,也不含有DNA及核糖体蛋白的结合位点。亚细胞定位结果显示,human akirin2严格定位在核内,通过荧光素酶报告基因检测我们发现随着细胞内human akirin2表达量的增加,细胞中的NF-κB报告基因的表达水平也随之增加,说明human akirin2确实在体内参与了NF-κB信号通路。另外,鉴于human akirin2序列上含有与14-3-3相互作用的位点,我们还对human akirin2与human 14-3-3β之间的相互作用进行了探究。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-iP)结果表明细胞内human akirin2和human 14-3-3β之间存在相互作用;对细胞核蛋白的定性定量分析我们发现激活状态细胞中human 14-3-3β发生了部分入核。综上,激活状态的细胞中一部分human 14-3-3β向细胞核中迁移并与细胞核中的human akirin2发生相互作用,共同完成一系列生理功能。成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRiSPRs)是原核生物获得性免疫过程中不可或缺的元件。2012年8月,Martin Jinek等人首次将CRiSPR-CAS9系统定向切割DNA的特性应用到了基因编辑中去。2013年1月,WoongY Hwang等人首先在模式生物斑马鱼中实现了利用CRiSPR-CAS9系统进行成体生物靶向基因的突变。此后,张博老师和肖安老师成功的利用Cas9介导的基因编辑技术在斑马鱼内实现了基因组内大片段DNA的删除并获得了多个非编码基因的缺失突变体。本研究选用几种斑马鱼生殖腺发育相关编码基因作为研究对象,利用Cas9介导的大片段DNA删除技术,来对基因内部的兴趣结构域进行了特异的删除,以期能够获得上述基因特定结构域缺失的斑马鱼,以便于接下来对上述基因特征结构域的功能进行更深入的探究,同时对pcr检测突变体的检出效率以及通过该方法获得突变体的概率进行统计分析。经过摸索,我们发现Cas9 mRNA的注射量为200pg,sgRNAs的注射量为200pg(两个sgRNA的注射量相同)时,胚胎发生缺失突变的突变效率较高且胚胎死亡率相对较低。对30dpf F0尾鳍的检测结果显示携带与预期大小一致的缺失突变发生的概率均大于33.3%。而检测F0突变的传代效率时我们发现,每个基因中至少存在两条携带可遗传缺失突变的F0,其缺失突变传代效率均大于5%,大部分在30%以上,有的甚至高达80%。通过对Zebrafish EAP1-iRFBP F1的靶位点所在序列进行测序分析,我们发现在所有我们检测的F1胚胎中,出现有效EAP1ΔiRF-2BP缺失突变体的概率为10%,在我们检出的发生缺失突变的F1胚胎中,出现有效EAP1ΔiRF-2BP缺失突变体的概率为16.7%。通过本部分研究,我们证明了 Cas9技术介导的大范围DNA片段删除技术不仅可以实现非编码基因的缺失突变,还可用于在编码基因内部实现特定结构域的缺失,并且不影响该基因剩余部分的表达,可以用来更准确的分析预测蛋白结构域的功能。EAP1是在下丘脑中表达的一种转录调控因子,作用于大脑神经内分泌过程中,在非人类灵长类动物(nonhuman primate,NHP)和啮齿类动物的青春期会出现选择性的表达上调,它可以直接激活促性腺激素释放激素(gonadotropin-relea

关键词： Akirin NF-κB human 14-3-3β 功能研究 CRiSPR-CAS9 基因编辑功能域缺失突变 zebrafish EAP1 i-scei 转基因重组载体构建