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作者：赵艳利郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的Graves病（Graves disease,GD）和桥本氏甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis,HT）是临床上最常见的自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid diseases,AITD）,但其发病机理尚未完全阐明。近年来的研究表明,细胞凋亡受体的激... 详细信息

背景与目的Graves病（Graves disease,GD）和桥本氏甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis,HT）是临床上最常见的自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid diseases,AITD）,但其发病机理尚未完全阐明。近年来的研究表明,细胞凋亡受体的激活及调节细胞凋亡的因子参与AITD的发病过程。Livin、热休克蛋白90α（heat shock protein 90α,hsp90α）和聚集素（Clusterin）蛋白是体内重要的抗凋亡因子。Livin蛋白主要通过抑制Caspase途径、激活转化因子β激酶1（TAK1）依赖的c-jun N端激酶1（JNK1）信号转导途径发挥抗凋亡作用。hsp90α既可通过阻止procaspase-9与凋亡蛋白酶活化因子1凋亡体的结合而抑制凋亡的发生,又可通过构象的特异性与突变型p53结合,导致突变型p53复合体积聚,使细胞半衰期延长。hsp90α蛋白亦可通过阻止细胞分裂来发挥重要的抗凋亡作用。另外hsp90α还具有重要的免疫作用,在抗原的加工与呈递过程的研究中发现,热休克蛋白促进了这一分子的装配过程。而且,热休克蛋白自身可作为不同类病原体的主要抗原以及健康个体免疫系统的靶蛋白。Clusterin蛋白是一种具有细胞保护功能的蛋白质,具有抗凋亡作用。Clusterin也可与补体C5b-6结合,阻止其对补体C7、C8、C9的激活,抑制攻膜复合体C5b6789的形成,从而阻止补体介导的细胞溶解。关于Livin和hsp90α在GD和HT患者甲状腺组织中的表达,目前国内外均未见报道。Clusterin蛋白在GD和HT患者甲状腺组织中的表达,目前国内未见报道,国外仅有一篇。为此本研究采用S-P免疫组织化学方法,对Livin、hsp90α和Clusterin蛋白在GD和HT中的表达进行研究并分析其之间的相关性,以探讨Livin、hsp90α、Clusterin蛋白在GD和HT发生发展中的作用。材料和方法1.采用SP免疫组织化学技术检测26例GD、15例HT患者手术切除的甲状腺组织和11例正常甲状腺组织（取自良性腺瘤旁甲状腺组织）标本中Livin、hsp90α、Clusterin蛋白的表达。2.结果判定:由两个不了解临床资料的病理医师分别观测切片判定染色结果,取其平均值。以GD、HT及正常甲状腺组织细胞质、细胞膜和（或）细胞核被染成棕黄色颗粒状物作为Livin、hsp90α和Clusterin蛋白阳性染色。在随机选取的10个高倍视野（×400）下半定量划分染色等级:（-）:显色强度与背景无明显差别;（+）:阳性细胞数＜10%,显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色;（++）:阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间;（+++）:阳性细胞数＞60%,多数细胞呈黄至棕黄色染色。3.统计学处理所有数据均经SPSS 12.0软件进行统计学检验。两样本或多样本阳性表达率的比较应用χ检验,小样本资料应用Fisher精确概率法。相关性检验采用Spearman等级相关分析,以α=0.05作为显著性检验水准。结果***、hsp90α蛋白定位于甲状腺滤泡上皮细胞的胞质和胞核,Clusterin蛋白主要定位于甲状腺滤泡上皮细胞的胞质和胞膜,呈异质性表达,阳性着色为棕黄色颗粒。Livin、hsp90α、Clusterin蛋白在间质纤维母细胞、血管内皮细胞和浸润的淋巴细胞等均未见表达。Livin蛋白在正常甲状腺组织和GD主要表达在胞核。Livin蛋白在HT主要表达在胞质,在淋巴细胞浸润区附近的滤泡上皮细胞表达较强,Livin蛋白在结构完整、上皮细胞数目多、胞浆丰富的甲状腺滤泡表达较强,而在结构破坏、上皮细胞胞浆少、萎缩的甲状腺滤泡表达相对较弱。hsp90α蛋白在正常甲状腺组织、GD和HT中均以胞质表达为主。hsp90α蛋白在GD和HT中淋巴细胞浸润区的表达与远离淋巴细胞浸润区的表达均无明显差别。Clusterin蛋白在正常甲状腺组织无表达;在GD主要表达在甲状腺滤泡上皮细胞胞质和胞膜;在HT中,Clusterin蛋白主要表达在滤泡上皮细胞的胞质和胞膜,滤泡腔侧细胞膜较基底膜侧细胞膜着色强,另外在间质中浸润的淋巴细胞形成的淋巴滤泡的生发中心,可见一些有枝蔓状突起的细胞阳性表达Clusterin蛋白,根据其形态,推测为滤泡树突状细胞。***、hsp90α、Clusterin蛋白在GD和HT中的表达均明显高于正常甲状腺组织（P均＜0.05）,Livin、hsp90α蛋白在GD和HT中的表达均无明显差别（P均＞0.05）。Clusterin蛋白在HT中的表达明显高于GD（P＜0.05

关键词： Graves病桥本甲状腺炎 Livin hsp90α Clusterin 免疫组织化学

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CTSD、hsp90α、EGFR在胃癌组织中的表达及临床意义

CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌组织中的表达及临床意义

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作者：李禹南华大学

学位级别：硕士

[目的]检测组织蛋白酶D(Cathepsin D,CTSD)、热休克蛋白90a (Heat Shock Protein 90α,hsp90a)和表皮生长因子受体(Epidemal growth factor receptor,EGFR)蛋白及其mRNA在正常胃粘膜组织、癌旁不典型增生组织、胃癌(Gastric Cancer, GC)组织及GC淋巴结转移组织中的表达情况,分析它们的表达水平与GC临床病理特征的关系,初步探讨CTSD、hsp90α、EGFR在GC发生、发展及浸润转移过程中的作用,为GC临床诊断、基因治疗及预后判断提供实验依据。[方法](1)采用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)及原位杂交法(Insituhybridization,JSH)检测正常胃粘膜组织、癌旁不典型增生组织、GC组织及GC淋巴结转移组织中CTSD、hsp90α、EGFR蛋白及其mRNA的表达情况。(2)运用卡方检验分析不同胃组织间CTSD、hsp9Oα、EGFR蛋白及其mRNA表达的差异,应用Kappa检验比较IHC和ISH的检测结果,运用等级相关检验分析CTSD、hsp90a及EGFR的表达水平与GC患者临床病理特征的关系及这三者之间的相关性。[结果](1)在110例正常胃粘膜组织、83例癌旁不典型增生组织、110例GC组织及78例GC淋巴结转移组织中,CTSD蛋白的阳性表达率分别为0、18.07%、80.91%、89.94%;其mRNA的阳性表达率分别为0、7.22%、65.45%、76.92%,且CTSD蛋白及mRNA的表达水平随着胃黏膜病变由良性向肿瘤进展而逐渐升高;CTSD蛋白及mRNA在GC组织中的表达水平较正常胃粘膜组织、癌旁不典型增生组织明显上调,在GC淋巴结转移组织的表达水平高于GC组织(P0.05)(2)在110例正常胃粘膜组织、83例癌旁不典型增生组织、110例GC组织及78例GC淋巴结转移组织中,hsp90a蛋白的阳性表达率分别为0.9%、15.66%、75.45%、89.74%,其mRNA的阳性表达率分别为0、14.46%、60.91%,、67.95%,且hsp90a蛋白及mRNA的表达水平随着胃黏膜病变严重程度的升高而升高。hsp90a蛋白及mRNA在GC组织、GC淋巴结转移组织中的表达水平较正常胃黏膜组织、癌旁不典型增生组织明显上调(Phsp90a蛋白的表达水平与肿瘤的分化程度呈负相关(r=-0.353,Phsp90a表达水平越高,肿瘤分化越差;与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移个数及TNM分期呈正相关(r=0.440, r=0.340、r=0.592, Phsp90a表达水平越高,肿瘤浸润深度越深,淋巴结转移个数越多,TNM分期越高,与患者的年龄、性别及肿瘤大小无关(P>0.05)(3)在110例正常胃粘膜组织、83例癌旁不典型增生组织、110例GC组织及78例GC淋巴结转移组织中,EGFR蛋白的阳性表达率分别为0、12.05%、69.09%、84.62%,其mRNA的阳性表达率分别为0、12.05%、60.91%、75.64%,且EGFR蛋白及mRNA表达水平随着胃黏膜病变由良性向肿瘤进展而升高;EGFR蛋白及mRNA在GC组织、GC淋巴结转移组织的表达较正常胃黏膜组织及癌旁不典型增生组织升高(P0.05)(4)统计学分析显示CTSD、hsp90α与EGFR在GC组织中的表达水平呈现两两相关,CTSD蛋白与hsp90a蛋白在GC组织中的表达呈正相关(r=0.853,Phsp90a蛋白与EGFR蛋白在GC组织中的表达呈正相关(r=0.734,,P<0.05);CTSD蛋白与EGFR蛋白在GC组织中的表达呈正相关(r=0.639,P<0.05)。[结论

关键词：胃癌 CTSD hsp90α EGFR 临床病理特征

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持续热应激下虹鳟热应激蛋白基因hsp90α和hsp10 mRNA表达、组织损伤及血细胞凋亡变化

持续热应激下虹鳟热应激蛋白基因HSP90α和HSP10 mRNA表达、组织...

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作者：周彦静甘肃农业大学

学位级别：硕士

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是典型的冷水性鲑鳟鱼类,对于温度的变化敏感,在集约化网箱养殖过程中,夏季高温极易引起虹鳟热应激反应,进而造成减产甚至死亡。虹鳟由于其对温度和环境的敏感性,在许多热应激研究中被认为是很好的模式生物。... 详细信息

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)是典型的冷水性鲑鳟鱼类,对于温度的变化敏感,在集约化网箱养殖过程中,夏季高温极易引起虹鳟热应激反应,进而造成减产甚至死亡。虹鳟由于其对温度和环境的敏感性,在许多热应激研究中被认为是很好的模式生物。为探索不同水温下虹鳟的热应激反应程度及机制,本研究以全同胞个体为试验对象,通过缓慢升温处理,分别在18℃、21℃、23℃、24℃、25℃和26℃6个温度点各挑选10尾鱼,测定hsp90α和hsp10在不同组织中的表达变化(肝脏、鳃、中肾、脑、心脏、脾脏和肌肉)和血细胞凋亡情况以及观察肝脏组织的形态学变化情况。具体结果如下:1.热处理虹鳟,机体各组织中hsp90α和hsp10 mRNA表达量发生变化,且呈明显的组织特异性。其中hsp90α主要在脑、心脏和肝脏中表达,hsp10主要在肝脏和心脏中表达。随水温的升高,鳃、中肾、脑、心脏和肌肉中hsp90αmRNA表达量逐渐升高;肝脏在21℃、25℃和26℃时表达量显著高于其他温度点(phsp90α表达量在24℃达到最大,显著高于18℃、21℃和23℃(phsp10 mRNA表达量不受水温影响;肝脏、心脏和肌肉中表达量出现不同程度的上调;鳃中表达量随水温升高持续升高;中肾表达量随水温升高出现小幅度的降低后持续升高;脾脏中表达量在后期(24℃、25℃、26℃)显著高于前期(phsps表达水平呈组织特异性及温度依赖性;血细胞中活细胞、凋亡及坏死率均受水温影响明显;肝脏损伤程度逐渐加重。21℃时虹鳟已出现热应激反应,25℃是虹鳟热应激下组织损伤的临界温度点。

关键词：虹鳟热应激 hsp90α hsp10 肝损伤血细胞凋亡

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TAP、hsp90α联合肺癌肿瘤标志物对小细胞肺癌诊断价值

TAP、Hsp90α联合肺癌肿瘤标志物对小细胞肺癌诊断价值

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作者：高敏安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景肺癌是中国、也是全世界范围内最常见的癌症。根据其组织病理学分类,可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）两种,其中SCLC与NSCLC相比,SCLC的生物学行为明显存... 详细信息

研究背景肺癌是中国、也是全世界范围内最常见的癌症。根据其组织病理学分类,可分为小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）两种,其中SCLC与NSCLC相比,SCLC的生物学行为明显存在不同,其恶性程度极高、发展迅速、侵袭性高、转移早、预后差,且5年总体生存率极低;根据2019年NCCN指南第1版已经明确指出,若针对SCLC患者其纵膈淋巴结未被侵犯的,及时采取手术治疗,可以大大提高患者的生存率,但在临床工作中SCLC被诊断时,往往纵膈淋巴结已累及,符合手术治疗条件的患者极少,易错过最佳的治疗时期,因此对肺癌的及时发现和确诊是降低肺癌病死率的关键。目前随着临床技术的不断发展,SCLC的诊断方式多种多样,但均存在一定的局限性,已经有相关文献报道,肺癌患者血清中的异常糖链糖蛋白（Tumor Abnormal Protein,TAP）、热休克蛋白90α（Heat shock protein 90α,hsp90α）水平可作为新型肿瘤标志物用于临床早期诊断;但关于TAP、hsp90α与肺癌肿瘤标志物联合检测对SCLC诊断的研究,目前国内外相关文献报道较少。因此,本文研究将探讨TAP、hsp90α联合肺癌肿瘤标志物癌胚抗原（carcinoembryonic,CEA）、细胞角蛋白19片段抗原（CYFRA21-1）、神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase,NSE）诊断SCLC的价值,旨在为SCLC的临床诊断、治疗以及疗效评估提供一定参考价值。研究目的探讨TAP、hsp90α联合肺癌肿瘤标志物（CEA、CYFRA21-1、NSE）诊断SCLC的临床价值。研究方法通过采用酶联免疫法和电化学发光法检测50例SCLC,62例NSCLC及62例肺良性疾病患者血清中TAP、hsp90α、肺癌肿瘤标志物的表达水平,并对其检测结果进行统计分析;同时绘制ROC曲线,确定各项指标诊断SCLC的最佳截断值,计算肿瘤标志物单独检测时及联合检测诊断SCLC的敏感度和特异度,ROC曲线下面积（AUC）,评估其临床诊断效能。研究结果通过对相关数据进行统计分析,并采用ROC曲线结果显示,TAP的截断值为203.96μm2、ROC曲线下面积（AUC）为0.613、敏感度为32.00%、特异度90.32%;hsp90α的截断值、AUC、敏感度、特异度分别为64.61 ng/m L、0.669、78.00%、50.00%;CEA分别为2.90 ng/m L、0.656、40.00%、85.48%;CYFRA21-1分别为3.66 ng/m L、0.671、52.00%、77.41%;NSE分别为23.33 ng/m L、0.826、74.00%、82.26%。五项肿瘤指标联合检测的AUC为0.901、敏感度为92.00%、特异度为75.81%。由此可知,肺癌患者血清中的相关肿瘤标志物对SCLC联合诊断时的敏感度、AUC均明显高于肿瘤标志物单独检测。研究结论TAP、hsp90α联合肺癌肿瘤标志物检测对SCLC具有较高的诊断效能,能够弥补单项检测的不足,具有重要临床指导意义。

关键词：联合检测 TAP hsp90α 肺癌肿瘤标志物小细胞肺癌

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化积益肝煎调节小鼠荷H22移植性肝癌细胞EGF、hsp90α和TGFβ2表达的实验影响

化积益肝煎调节小鼠荷H22移植性肝癌细胞EGF、HSP90α和TGFβ2表...

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作者：孙红晓大连医科大学

学位级别：硕士

目的:研究化积益肝煎对小鼠移植性肝癌的抑制作用及其对EGF、hsp90α和TGF-β2表达的影响,以探讨其抗肿瘤的可能机制。方法:建立小鼠荷H22移植性肝癌模型,设立生理盐水对照组、化积益肝煎治疗组,西药治疗组(5-Fu)和联合治疗组(化积益肝... 详细信息

目的:研究化积益肝煎对小鼠移植性肝癌的抑制作用及其对EGF、hsp90α和TGF-β2表达的影响,以探讨其抗肿瘤的可能机制。方法:建立小鼠荷H22移植性肝癌模型,设立生理盐水对照组、化积益肝煎治疗组,西药治疗组(5-Fu)和联合治疗组(化积益肝煎和5-Fu联用),14天后比较各治疗组抑瘤效果的强弱;利用免疫组织化学技术、图像分析技术定量检测、比较各组移植性肝癌组织中EGF、hsp90α和TGF-β2的表达。结果:1.各治疗组对小鼠移植性肝癌瘤组织的生长抑制实验结果如下:生理盐水对照组(n=14)瘤重为1.178±0.247g;化积益肝煎治疗组(n=12)瘤重为0.657±0.132g,抑瘤率为44.23%,与生理盐水对照组比较,有显著性差异(Phsp90α表达,四组均呈阳性表达。图像分析技术和单因素方差分析表明,EGF、hsp90α化积益肝煎治疗组表达下调,与生理盐水对照组比较,有显著性差异(Phsp90α表达上调,使TGF-β2的表达下调。

关键词：化积益肝煎移植性肝癌 EGF hsp90α TGF-β2

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氧化应激诱导的G2/M期阻滞中hsp90α对Cyclin B1降解的调控机制

氧化应激诱导的G2/M期阻滞中Hsp90α对Cyclin B1降解的调控机制

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作者：马晓姣南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景氧化应激(Oxidative Stress)是由于机体受到各种有害刺激时,体内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生和消除之间出现不平衡所致,在多种疾病的发生、发展中起着重要作用。机体在正常状态下可产生少量ROS参与正常生理活... 详细信息

研究背景氧化应激(Oxidative Stress)是由于机体受到各种有害刺激时,体内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生和消除之间出现不平衡所致,在多种疾病的发生、发展中起着重要作用。机体在正常状态下可产生少量ROS参与正常生理活动,同时体内存在清除自由基、抑制自由基反应的体系,保持自由基的产生和清除平衡。但在某些病理状态下,一旦平衡机制被破坏,体内显著增加的自由基可直接致机体损伤。在多种环境损伤和疾病中,ROS产生和消除之间的稳态失衡会引起氧化应激,并最终导致衰老、肿瘤发生、心血管疾病、神经退行性病变、风湿性关节炎和肺组织炎性病变等的发生。热休克蛋白(heat shock proteins, hsps),是指机体细胞的hsp基因在应激原诱导下被激活,并高效表达的具有高度保守性质的一组蛋白质。hsp可与多种蛋白形成复合体,参与蛋白的折叠与伸展、多聚复合体的组装。由于其在不改变靶蛋白结构的基础上发挥其调节靶蛋白的作用,故被称为“分子伴侣”(Molecular Chaperone)。Christians等根据其相对分子质量不同,将hsps分成大分子hsp(110-100kDa)、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、小分子hsp(30～18kDa)及泛素(7-8kDa)等家族。其中hsp90通过与多种蛋白激酶及类固醇激素受体结合,在细胞信号转导中起着重要作用,并与肿瘤的发生发展关系密切,已成为当前研究热点。已知hsp90在肿瘤细胞中高表达,超出正常细胞2-10倍,在肿瘤细胞的生长和存活中起重要的调节作用,是多种癌基因通路中的重要组成部分;已作为抗肿瘤药物的作用靶点,其多种抑制剂研发已进入临床Ⅲ期试验阶段。 hsp90分子伴侣功能一方面表现为对底物蛋白的促折叠作用,另一方面通过其共伴侣分子,协同泛素蛋白酶体系统,对错误折叠的蛋白质进行分选降解。CHIP(rcarboxy terminus of Hsc70interacting protein)是hsp90的一个重要的共伴侣蛋白,亦是参与蛋白质量控制的泛素E3连接酶,可促进泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome pathway, UPP)降解多种蛋白底物,在热应激、心肌细胞损伤、细胞凋亡、肿瘤等病理生理过程中发挥重要作用。泛素-蛋白酶体系统参与多种调控蛋白质的更新和加工过程,是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径之一,人体细胞内约70%蛋白质都经由其降解,在细胞的多种生命进程中都发挥重要作用,如参与核酸密码翻译、细胞周期、信号转导等多种重要的生理过程和多种疾病的发生发展。分子伴侣和蛋白水解酶共同参与组成蛋白质质量控制(protein quality control, PQC)系统。蛋白质能否重新正确折叠或被及时识别降解,是细胞在维持氧化应激下的正常功能和存活关键所在。细胞周期调控蛋白有序降解是细胞周期顺利进展的关键,并与蛋白质质控系统关系密切。细胞周期调控机制的失活,特别是G1/S期和G2/M期检测点(check point)的失活在细胞癌变过程中起着至关重要的作用。周期调控机制发生异常后可造成细胞的持续性增殖,是肿瘤发生的生物学基础,肝癌的发生亦是如此。各种致瘤因素最终将影响细胞周期,导致细胞生长、分化失控。Cyclin B1作为G2/M期的周期调控蛋白,活化并与CDK1形成复合物,促使细胞进行G2/M期转变。若Cyclin B1蓄积并伴随磷酸化受阻,会导致Cyclin B1入核受阻,细胞阻滞于G2期;若Cyclin B1降解受阻,细胞将停滞于M期;因此Cyclin B1的降解紊乱直接导致细胞有丝分裂的异常。已知氧化应激下细胞周期调控与蛋白质质控系统的关系密切,作为蛋白质质控系统的重要伴侣分子hsp90,对维持氧化应激下细胞的正常功能和存活至关重要。蛋白质质控系统中,分子伴侣hsp90及其共伴侣分子CHIP对底物蛋白的降解发挥着重要作用。氧化应激所致细胞周期阻滞状态下,hsp90及其共伴侣分子CHIP参与细胞周期蛋白Cyclin B1降解的调控机制,以及三者之间是如何相互作用的,尚未清楚,上述机理的阐明必将对研究各种应激性疾病的发生机制和预防提供新的思路。目的： 1.建立氧化应激诱导的G2/M期阻滞的HepG2细胞模型;2.通过ShRNA干扰方法建立稳定的hsp90a表达抑制的HepG2细胞株,研究氧化应激条件下,对照组和干扰组不同时间点HepG2细胞内hsp90α、Cyclin B1和CHIP的表达情况;3.确定hsp90a表达抑制与G2/M期阻滞的因果关系;4.研究氧化应激诱导的G2/M期阻滞中,HepG2细胞内hsp90a及其共伴侣分子CHIP对Cyclin B1表达情况的影响和三者的相互作用情况;

关键词：氧化应激 hsp90α Cyclin B1 CHIP

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禽病毒性肿瘤发生过程中血浆内hsp90α蛋白的检测

禽病毒性肿瘤发生过程中血浆内Hsp90α蛋白的检测

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作者：陈媛媛山东农业大学

学位级别：硕士

病毒性肿瘤在鸡群中较为常见,导致鸡的生产性能下降及死亡率升高,给家禽业带来巨大的经济损失。肿瘤的发生和发展的分子机理、抗肿瘤疫苗的发现与研发、鸡场病毒的净化是目前亟待解决的科学问题,随着对肿瘤发生机理认识的深入,热休克蛋... 详细信息

病毒性肿瘤在鸡群中较为常见,导致鸡的生产性能下降及死亡率升高,给家禽业带来巨大的经济损失。肿瘤的发生和发展的分子机理、抗肿瘤疫苗的发现与研发、鸡场病毒的净化是目前亟待解决的科学问题,随着对肿瘤发生机理认识的深入,热休克蛋白在肿瘤发生中的重要作用被逐步揭示。热休克蛋白90α(hsp90α)是伴侣蛋白,可以辅助蛋白折叠和维持细胞内多种信号传导,从而促进细胞存活和生长。2009年,清华大学罗永章团队在世界上首次宣布了人体肿瘤细胞特异分泌hsp90α的调控机理,同时首次揭示了细胞外hsp90α与细胞内hsp90α的分子差异。该团队进一步证明了分泌型hsp90α能促进肿瘤侵袭及转移,且其在血液中的含量与肿瘤恶性程度正相关。经过大量的临床试验,成功证明了hsp90α是人肺癌相关肿瘤标志物,可用于患者病情监测和疗效评价。但是,hsp90α与家禽肿瘤病的关系尚无明确的定论。本论文的工作主要研究家禽发生病毒性肿瘤病(禽白血病和马立克氏病)时,血液中hsp90α的含量及其变化;以及急性转化型ALV对鹌鹑的致病性。本试验将鸡急性纤维肉瘤研磨液、辅助病毒(外源性非急性转化型禽白血病病毒)、PBS分别于腹腔和颈部皮下接种的两种方式对1日龄海兰褐鸡进行攻毒,连续三周采取抗凝血,2 000 r/min 4℃离心2min,取上层血浆,取其中100μL(剩余血浆-80℃保存)接种到已经贴壁的CEF 96孔细胞培养板,2h后换细胞培养维持液培养7天,取上清经ALV-p27抗原检测试剂盒检测。剩余血浆用于检测在病毒血症发展过程中血浆中hsp90α的含量,通过对病理组织切片HE染色的方法对肿瘤组织进行病理组织学的观察与研究;同时本试验还将急性纤维肉瘤的研磨液,分别在鹌鹑的幼雏期和成年期,采取颈部皮下和腹腔接种的方式攻毒,以研究鹌鹑对急性纤维肉瘤的病毒易感性。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的整合有网状内皮组织增生症病毒长末端重复序列的第一株重组野毒株。本试验分别对7日龄SPF鸡人工腹腔接种MDV GX0101毒株、1日龄免疫7日龄腹腔接种MDV GX0101毒株、7日龄腹腔接种PBS,三种方式构建马立克病肿瘤模型,连续三周采取无菌抗凝血,2 000 r/min 4℃离心2min,取上层血浆接种CEF细胞,7天后检测细胞上清病毒感染情况,剩余的血浆用于检测病毒血症发展过程中hsp90α的含量,并通过对病理组织切片HE染色的方法对肿瘤组织进行病理组织学的观察与研究。结果显示,禽白血病急性肿瘤组的hsp90α平均含量高于辅助病毒组及空白对照组;禽马立克氏病攻毒组的hsp90α平均含量高于疫苗组和空白对照组。说明受肿瘤病毒感染后的鸡血液中hsp90α含量有一定程度的升高,病毒引起的应激促使hsp90α表达量增加。该结论为后期建立家禽肿瘤病与hsp90α含量之间的相关关系做铺垫,有助于研究在家禽上应用以hsp90α为靶向确定家禽肿瘤病的血液学研究。而在急性纤维肉瘤对鹌鹑的易感性方面的研究中,无论是1日龄幼雏或是60日龄成年的鹌鹑进行腹腔或颈部皮下接毒,p27检测、斑点杂交试验,均为阴性,未检测出病毒的存在,剖检查看,无眼观可见的肿瘤结节等特征性的肿瘤病变。表明鹌鹑对致急性纤维肉瘤病毒不易感,体内不会有急性纤维肉瘤产生。。急性缺陷型病毒在鹌鹑体内的作用机制如何,需有关实验进一步研究。

关键词：急性纤维肉瘤马立克氏病 hsp90α 检测

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小剂量胰岛素和hsp90α在糖尿病难愈性创面中的作用

小剂量胰岛素和Hsp90α在糖尿病难愈性创面中的作用

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作者：张月第四军医大学

学位级别：硕士

糖尿病患者皮肤容易受损，损伤后创面延迟愈合或不愈合形成糖尿病难愈性创面。随着世界范围内人口老龄化、肥胖及糖尿病等的发生率越来越高，糖尿病难愈性创面的发生率也逐年升高，由于其治疗花费高且效果不明显，不仅给社会带来巨大的... 详细信息

糖尿病患者皮肤容易受损，损伤后创面延迟愈合或不愈合形成糖尿病难愈性创面。随着世界范围内人口老龄化、肥胖及糖尿病等的发生率越来越高，糖尿病难愈性创面的发生率也逐年升高，由于其治疗花费高且效果不明显，不仅给社会带来巨大的经济压力，同时也给患者身心健康及生活造成较大的影响。目前糖尿病难愈性创面的发病机制尚不清楚，临床上也缺乏有效的治疗方法。动物模型研究表明在急性和慢性创面使用胰岛素，能够明显缩短创面愈合时间，加快创面愈合的速度，但会影响全身血糖水平，且具体作用机制不清。研究发现在缺氧条件下，细胞能够分泌hsp90α至胞外，这些分泌的hsp90α能够促进角质形成细胞和成纤维细胞的迁移，从而促进创面的愈合，其机制有待于进一步的研究。为了进一步探索小剂量胰岛素和hsp90α对糖尿病难愈性创面的作用及其作用机制，本研究采用高糖高脂饲料结合小剂量STZ诱导糖尿病大鼠模型，并建立糖尿病大鼠背部2cm×2cm全层皮肤缺损创面，模拟人类糖尿病难愈性创面，同时建立正常大鼠创面模型作为空白对照组（O组），糖尿病大鼠随机分组后分别给予创面凡士林（B组）、小剂量胰岛素（C组）、hsp90α（D组）及小剂量胰岛素和hsp90α联合应用（E组），并以未处理的糖尿病创面作为实验对照组（A组），大体观察各组创面的愈合情况并拍照，记录创面愈合时间并计算创面愈合率，分别在创面建立后第3、7、10、15、21天取创面组织标本，通过HE染色和MASSON染色观察各时间点各组创面组织标本中新生上皮组织、炎性细胞浸润、新生毛细血管、胶原纤维密度和排列等情况，分析创面上皮化、血管化及纤维化等愈合质量情况，使用RT-PCR检测各时间点创面组织中与创面愈合有关的生长因子VEGF、TGF-β1、IGF-1、TNF-α及IL-1的表达情况，同时通过免疫组织化学染色及微血管计数检测各时间点各组创面组织中CD31的表达，进而分析创面中血管生成情况。实验结果表明，给予SD幼鼠4周以上高糖高脂饲料饲养后，腹腔注射1%、25mg/kg的STZ，能够诱导稳定的类似于人类2型糖尿病临床表现的糖尿病大鼠模型。建立背部创面模型并给予相应处理观察发现，对照组O组大鼠创面完全上皮化时间为（16.4±1.5）d，实验组糖尿病大鼠各组创面完全上皮化时间分别为A组（35.5±0.9）d，B组（31.4±1.2）d，C组（25.3±1.8）d，D组（25.6±1.4）d，E组（20.3±1.4）d，C、D、E组创面的愈合时间与A、B组相比明显缩短，但均较O组延长，各组间差别具有统计学意义（P＜0．05）。与对照组O组相比，实验组各组创面愈合率明显降低，与A组相比，B、C、D、E组创面愈合率提高，尤以E组为甚，各组间差异具有统计学意义（P＜0．05）。HE染色结果表明，在相同时间点，与A、B组相比，C、D、E组上皮化速度较快，炎性细胞浸润较少，成纤维细胞增生及新生血管形成较多，尤以E组为甚，但均不及O组。Masson染色结果显示在相同时间点，C、D、E组胶原纤维排列及密度较A、B好，尤以E组为甚，但均不及O组。RT-PCR结果表明C、D、E组中VEGF、TGF-β1、IGF-1、TNF-α及IL-1的表达明显高于A、B两组，但均低于O组，差别具有统计学意义（P＜0．05）。CD31免疫组织化学染色及微血管计数发现在相同时间点中，C、D、E组创面标本中的血管数量明显高于A、B两组，尤以E组为甚，但均低于O组，差异具有统计学意义（P＜0．05）。以上实验结果表明，高糖高脂饲料饲养结合小剂量STZ可诱导出稳定的2型糖尿病大鼠模型;糖尿病大鼠创面的愈合较正常大鼠创面愈合延迟;在不影响空腹血糖浓度情况下，局部使用小剂量胰岛素和hsp90α均可通过上调VEGF、TGF-β1、IGF-1、TNF-α及IL-1的表达，促进创面的上皮化、纤维化和新生血管形成，明显缩短糖尿病难愈性创面的愈合时间，加快创面愈合的速度，而两者联合应用后效果更为显著。

关键词：糖尿病难愈性创面创面愈合小剂量胰岛素 hsp90α

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iPSCs源性微囊泡/hsp90α在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用及机制研究

iPSCs源性微囊泡/Hsp90α在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用及机...

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作者：吴锐军南方医科大学

学位级别：硕士

第一部分 miPSCs源性微囊泡在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用及机制研究(一)目的探讨miPSC源性微囊泡(miPSCs-MVs)治疗小鼠深Ⅱ度烫伤的作用及相关机制。(二)方法一.miPSCs-MVs在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用1.收集miPS细胞条件培... 详细信息

第一部分 miPSCs源性微囊泡在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用及机制研究(一)目的探讨miPSC源性微囊泡(miPSCs-MVs)治疗小鼠深Ⅱ度烫伤的作用及相关机制。(二)方法一.miPSCs-MVs在小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合中的作用1.收集miPS细胞条件培养基提取细胞外囊泡并鉴定。***-MVs局部注射治疗小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤,大体及HE染色观察伤口愈合情况。3.活体成像及冰冻切片观察PKH-67标记的miPSCs-MVs在体内的稳定性。二.miPSCs-MVs促进小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合的机制***-67标记miPSCs-MVs,观察HaCaT细胞摄入情况;CCK-8、细胞EdU、细胞划痕实验观察miPSCs-MVs对细胞增殖和迁移的影响。***高通量测序、细胞划痕实验、细胞EdU实验筛选表达丰度高的miRNAs及其对HaCaT细胞迁移的影响。*** blot、qRT-PCR、双萤光素酶报告基因实验、细胞划痕实验探讨miR-16-5p的靶蛋白及信号通路。三.miR-16-5p对小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合的作用将miR-16-5p运用于小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤治疗,大体、HE染色、EdU染色及免疫组织化学染色观察伤口愈合及上皮化情况。(三)结果1.提取的胞外囊泡具有双膜结构,平均粒径为214.6 nm。***-MVs组的伤口愈合率及上皮化比对照组显著性增强。3.小鼠活体成像显示miPSCs-MVs组烫伤后第1天红色信号区域明显;冰冻切片显示miPSCs-MVs组烫伤后第1天上皮细胞表达绿色荧光。***-MVs可被HaCaT细胞摄入并促进细胞迁移。***-16-5p在miPSCs-MVs中表达丰度最高,显著性促进HaCaT细胞迁移。***-16-5p靶向抑制Dsg3并通过p38信号通路促进细胞迁移。***-16-5p能显著性提高伤口愈合率并促进再上皮化进程。(四)结论miPSCs-MVs通过促进小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤伤口再上皮化过程,进而促进伤口愈合。miPSCs-MVs中的miR-16-5p通过靶向抑制Dsg3激活p38信号通路从而促进细胞迁移。miR-16-5p能促进小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤的愈合。第二部分 hsp90α在miPSCs-KCs促进小鼠皮肤深度Ⅱ度烫伤愈合中的作用和机制研究(一)目的探讨hsp90α在小鼠诱导多能干细胞源性角质形成细胞(miPSCs-KCs)促进小鼠皮肤深度Ⅱ度烫伤愈合中的作用及机制。(二)方法1.将miPSCs诱导分化为角质形成细胞,免疫荧光染色检测角质形成细胞标志蛋白的表达。2.将 PBS、miPSCs-KCs、hsp90α、miPSCs-KCs 联合 hsp90α 分别注射于小鼠腹部深Ⅱ度烫伤伤口处,大体、HE染色观察伤口愈合及上皮化情况。***标记miPSCs-KCs,冰冻切片观察miPSCs-KCs移植情况。*** 实验检测 hsp90α 对 miPSCs-KCs 迁移的影响,Western blot 检测Akt信号通路的变化。(三)结果***-KCs表达角质形成细胞标志蛋白。***-KCs联合hsp90α组伤口面积显著性减小,再上皮化显著性增强。*** 标记的 miPSCs-KCs 联合 hsp90 α组比 CSFE 标记的 miPSCs-KCs组的伤口上皮化部位表达更多绿色荧光。***90α能够促进miPSCs-KCs迁移,且激活Akt信号通路。(四)结论hsp90α可通过激活Akt信号通路促进miPSCs-KCs的迁移,从而增强miPSCs-KCs移植治疗小鼠皮肤深Ⅱ度烫伤愈合的作用。

关键词： miR-16-5p iPS细胞胞外囊泡 hsp90α 角质形成细胞深Ⅱ度烫伤

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三疣梭子蟹热休克蛋白hsp60和hsp90α的盐度适应相关性研究

三疣梭子蟹热休克蛋白HSP60和HSP90α的盐度适应相关性研究

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作者：覃烨上海海洋大学

学位级别：硕士

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要的经济蟹类，属于广盐性水生物种，整个生活史都受到外界水环境盐度的影响。从分子水平上了解三疣梭子蟹的渗透调节机制对三疣梭子蟹种质资源的改良和水产养殖具有重要意义。热休... 详细信息

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要的经济蟹类，属于广盐性水生物种，整个生活史都受到外界水环境盐度的影响。从分子水平上了解三疣梭子蟹的渗透调节机制对三疣梭子蟹种质资源的改良和水产养殖具有重要意义。热休克蛋白（Heat shock protein，hsps），是一组在生物进化过程中高度保守的蛋白分子。当机体受到逆境胁迫时，细胞内蛋白发生变性，而热休克蛋白可以识别变性蛋白的疏水区域，协助变性蛋白重新恢复天然构象，提高细胞的胁迫耐受性。热休克蛋白是包括多种分子的蛋白家族。其中，hsp60和hsp90是两类常见的热休克蛋白分子。hsp60具有变性蛋白优先结合能力，保护细胞免受逆境胁迫伤害;hsp90不仅能保护细胞不受胁迫伤害，还能与细胞功能蛋白特异结合，改变蛋白功能状态。利用简并引物，我们首次克隆得到三疣梭子蟹hsp60基因，其开放阅读框序列全长为1734bp，编码577个氨基酸，预测分子量为61.25kDa，等电点为5.23。该氨基酸序列包含hsp60家族信号位点以及特征基序。同源性分析与系统发育树表明三疣梭子蟹hsp60与已知的hsp60蛋白序列高度同源，与南美白对虾Litopenaeus vannamei hsp60亲缘关系最近，蛋白序列同源性为96%。利用半定量RT-PCR检测hsp60基因在肝、心、卵巢、腹肌、触角腺、真皮、肠、附肢肌肉、鳃9种不同组织中的表达。结果表明：hsp60mRNA在三疣梭子蟹各组织中均有表达。正常盐度条件下，hsp60在触角腺和肠中表达量略高于其它组织。低盐（10‰）胁迫12hr后，卵巢hsp60mRNA表达量明显增加（p＜0.01），约为胁迫前水平5.52倍，其次是鳃、心和附肢肌肉，分别为2.14、2.0、1.96倍，而触角腺、肠表达量显著减少（p＜0.05），约为0.44、0.36倍;高盐（40‰）胁迫12hr后，卵巢hsp60mRNA表达量显著增加（p＜0.001），约为胁迫前水平5.57倍，其次为真皮、鳃，约为3.66、2.4倍。盐度胁迫基本不影响肝、腹肌中的hsp60mRNA表达。利用半定量RT-PCR技术检测盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中hsp60基因随胁迫时间的表达情况。结果显示：10‰低盐胁迫24hr内，三疣梭子蟹hsp60mRNA表达量逐渐增加（p＜0.05），约为胁迫前水平2.5倍;40‰高盐胁迫12hr，hsp60mRNA表达量迅速增加到最大值，约为4.26倍，随后表达量减少。利用western blot技术检测了盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中hsp60蛋白随胁迫时间的表达情况。结果显示：10‰、40‰盐度胁迫后，三疣梭子蟹hsp60蛋白表达量在前24hr基本稳定，48hr表达量增加，之后表达量保持不变。利用半定量RT-PCR技术检测盐度胁迫下，三疣梭子蟹鳃中hsp90基因随胁迫时间的表达情况。10‰盐度实验组的三疣梭子蟹鳃hsp90α mRNA表达量逐渐减少（p＜0.05），120hr最低值约为胁迫前水平0.12倍，而40‰盐度实验组的hsp90α mRNA表达水平先上调后下降。40‰高盐胁迫12hr时hsp90α mRNA表达量稍有减少，随后在24hr时上调到最大值，约为胁迫前水平1.21倍，之后逐步下降，在120hr时达到最低值，约为0.22倍。为证明三疣梭子蟹hsp90α蛋白与盐度胁迫的相关性，我们根据GenBank上提供的三疣梭子蟹hsp90α基因蛋白编码区序列，构建pET28-hsp90α原核表达重组质粒在大肠杆菌DE3（BL21）中进行盐度胁迫表达。结果显示：重组质粒的大肠杆菌生存率明显高于转空载体的大肠杆菌，在越接近大肠杆菌盐度耐受极限值时，两者差异越显著，在盐度胁迫最高值（1050mmol/L）下，两者差异达到10.7倍。这说明在盐度胁迫下三疣梭子蟹hsp90α对大肠杆菌有保护作用,能显著提高大肠杆菌对盐度胁迫的耐受力。总结来看，盐度胁迫下，三疣梭子蟹hsp60mRNA和蛋白表达量均增加;以及鳃中hsp90α mRNA表达水平的提高与原核体外表达实验结果都暗示三疣梭子蟹hsp60和hsp90α可能参与了三疣梭子蟹盐度适应过程。本项研究丰富了热休克蛋白的分子功能，并为三疣梭子蟹淡水养殖的发展提供了一定的理论基础。

关键词：三疣梭子蟹P.trituberculatus hsp90α hsp60 盐度适应

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