氧化应激诱导的G2/M期阻滞中Hsp90α对Cyclin B1降解的调控机制

作     者：马晓姣 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈雪梅

授予年度：2012年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题：氧化应激 Hsp90α Cyclin B1 CHIP 

摘      要：研究背景 氧化应激(Oxidative Stress)是由于机体受到各种有害刺激时,体内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)产生和消除之间出现不平衡所致,在多种疾病的发生、发展中起着重要作用。机体在正常状态下可产生少量ROS参与正常生理活动,同时体内存在清除自由基、抑制自由基反应的体系,保持自由基的产生和清除平衡。但在某些病理状态下,一旦平衡机制被破坏,体内显著增加的自由基可直接致机体损伤。在多种环境损伤和疾病中,ROS产生和消除之间的稳态失衡会引起氧化应激,并最终导致衰老、肿瘤发生、心血管疾病、神经退行性病变、风湿性关节炎和肺组织炎性病变等的发生。 热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs),是指机体细胞的Hsp基因在应激原诱导下被激活,并高效表达的具有高度保守性质的一组蛋白质。Hsp可与多种蛋白形成复合体,参与蛋白的折叠与伸展、多聚复合体的组装。由于其在不改变靶蛋白结构的基础上发挥其调节靶蛋白的作用,故被称为“分子伴侣(Molecular Chaperone)。Christians等根据其相对分子质量不同,将Hsps分成大分子Hsp(110-100kDa)、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、小分子Hsp(30～18kDa)及泛素(7-8kDa)等家族。其中Hsp90通过与多种蛋白激酶及类固醇激素受体结合,在细胞信号转导中起着重要作用,并与肿瘤的发生发展关系密切,已成为当前研究热点。已知Hsp90在肿瘤细胞中高表达,超出正常细胞2-10倍,在肿瘤细胞的生长和存活中起重要的调节作用,是多种癌基因通路中的重要组成部分;已作为抗肿瘤药物的作用靶点,其多种抑制剂研发已进入临床Ⅲ期试验阶段。 Hsp90分子伴侣功能一方面表现为对底物蛋白的促折叠作用,另一方面通过其共伴侣分子,协同泛素蛋白酶体系统,对错误折叠的蛋白质进行分选降解。CHIP(rcarboxy terminus of Hsc70interacting protein)是Hsp90的一个重要的共伴侣蛋白,亦是参与蛋白质量控制的泛素E3连接酶,可促进泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome pathway, UPP)降解多种蛋白底物,在热应激、心肌细胞损伤、细胞凋亡、肿瘤等病理生理过程中发挥重要作用。泛素-蛋白酶体系统参与多种调控蛋白质的更新和加工过程,是生物体内蛋白质选择性降解的重要途径之一,人体细胞内约70%蛋白质都经由其降解,在细胞的多种生命进程中都发挥重要作用,如参与核酸密码翻译、细胞周期、信号转导等多种重要的生理过程和多种疾病的发生发展。分子伴侣和蛋白水解酶共同参与组成蛋白质质量控制(protein quality control, PQC)系统。蛋白质能否重新正确折叠或被及时识别降解,是细胞在维持氧化应激下的正常功能和存活关键所在。 细胞周期调控蛋白有序降解是细胞周期顺利进展的关键,并与蛋白质质控系统关系密切。细胞周期调控机制的失活,特别是G1/S期和G2/M期检测点(check point)的失活在细胞癌变过程中起着至关重要的作用。周期调控机制发生异常后可造成细胞的持续性增殖,是肿瘤发生的生物学基础,肝癌的发生亦是如此。各种致瘤因素最终将影响细胞周期,导致细胞生长、分化失控。Cyclin B1作为G2/M期的周期调控蛋白,活化并与CDK1形成复合物,促使细胞进行G2/M期转变。若Cyclin B1蓄积并伴随磷酸化受阻,会导致Cyclin B1入核受阻,细胞阻滞于G2期;若Cyclin B1降解受阻,细胞将停滞于M期;因此Cyclin B1的降解紊乱直接导致细胞有丝分裂的异常。 已知氧化应激下细胞周期调控与蛋白质质控系统的关系密切,作为蛋白质质控系统的重要伴侣分子Hsp90,对维持氧化应激下细胞的正常功能和存活至关重要。蛋白质质控系统中,分子伴侣Hsp90及其共伴侣分子CHIP对底物蛋白的降解发挥着重要作用。氧化应激所致细胞周期阻滞状态下,Hsp90及其共伴侣分子CHIP参与细胞周期蛋白Cyclin B1降解的调控机制,以及三者之间是如何相互作用的,尚未清楚,上述机理的阐明必将对研究各种应激性疾病的发生机制和预防提供新的思路。 目的： 1.建立氧化应激诱导的G2/M期阻滞的HepG2细胞模型;2.通过ShRNA干扰方法建立稳定的Hsp90a表达抑制的HepG2细胞株,研究氧化应激条件下,对照组和干扰组不同时间点HepG2细胞内Hsp90α、Cyclin B1和CHIP的表达情况;3.确定Hsp90a表达抑制与G2/M期阻滞的因果关系;4.研究氧化应激诱导的G2/M期阻滞中,HepG2细胞内Hsp90a及其共伴侣分子CHIP对Cyclin B1表达情况的影响和三者的相互作用情况;