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绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白C末端基因真核表达载体的构建

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畜牧与兽医 2018年第12期50卷 59-63页

作者：杨源王慧王军张云丹文明周碧君程振涛岳筠张双翔贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室贵州贵阳550025 贵州省动物疫病预防控制中心贵州贵阳550008

为探讨绵羊肺炎支原体(Mo) Hsp70蛋白作为核酸疫苗的可能性,在对Mo贵州分离株Hsp70蛋白基因进行生物信息学分析的基础上,选择Mo Hsp70蛋白C末端基因,将其与载体pcDNA 3.1 (+)进行连接构建重组质粒,通过脂质体转染至CHO细胞,采用RT-PCR... 详细信息

为探讨绵羊肺炎支原体(Mo) Hsp70蛋白作为核酸疫苗的可能性,在对Mo贵州分离株Hsp70蛋白基因进行生物信息学分析的基础上,选择Mo Hsp70蛋白C末端基因,将其与载体pcDNA 3.1 (+)进行连接构建重组质粒,通过脂质体转染至CHO细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光方法评价转染效果和真核细胞表达效果。结果显示:Mo贵州分离株Hsp70蛋白的C末端是具有优势抗原表位的区域,通过PCR方法成功扩增出567 bpHsp70蛋白的C末端基因,并成功构建pc DNA 3.1-hsp70重组质粒,在转染细胞中PCR扩增出预期大小的目的基因,可以观察到特异性的绿色荧光,提示本研究成功构建的重组质粒能在真核细胞中良好表达,为后续Mo Hsp70蛋白抗原性和免疫佐剂特性的研究奠定基础。

关键词：绵羊肺炎支原体 Hsp70蛋白核酸疫苗真核表达

+Gz暴露对大鼠海马Hsp70蛋白表达的影响

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航天医学与医学工程 2006年第4期19卷 277-280页

作者：韩磊孙喜庆李鸣皋马贵喜海军总医院航空潜水医学中心北京100037 第四军医大学航空航天医学系航空生物动力学教研室陕西西安710032

目的观察不同值的+G z暴露对大鼠海马Hsp70蛋白表达水平的影响,探讨+G z暴露诱导产生Hsp70蛋白的机制。方法100只SD大鼠随机分为对照组、+2G z暴露组、+6G z暴露组、+10G z暴露组,各组在+G z暴露后的6h、1d、2d、4d、6d处死,采用免疫组... 详细信息

目的观察不同值的+G z暴露对大鼠海马Hsp70蛋白表达水平的影响,探讨+G z暴露诱导产生Hsp70蛋白的机制。方法100只SD大鼠随机分为对照组、+2G z暴露组、+6G z暴露组、+10G z暴露组,各组在+G z暴露后的6h、1d、2d、4d、6d处死,采用免疫组织化学方法观察大鼠海马Hsp70蛋白表达情况,并对实验结果进行统计分析。结果3个+G z暴露组,Hsp70蛋白表达水平表现出相同的变化趋势:在+G z暴露后6h,Hsp70蛋白表达水平开始增加,1d达峰值,6d时基本恢复正常,而对照组没有这一变化趋势;不同+G z值之间的比较表明,+6G z组Hsp70蛋白表达水平最高,+10G z组最低。结论+G z暴露对大鼠海马Hsp70蛋白表达有显著影响,+6G z暴露时Hsp70蛋白表达水平最高。

关键词：正加速度 Hsp70蛋白 +Gz暴露海马

Hsp70蛋白在神经元样PC12细胞氧糖剥夺后的表达变化

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中国老年学杂志 2013年第12期33卷 2806-2807页

作者：何金婷莽靖胥桂华杨乐王姣琦包晓群徐忠信吉林大学中日联谊医院神经内一科吉林长春130033 吉林省人民医院

目的探讨神经细胞氧糖剥夺(OGD)造模后PC12细胞凋亡和热休克蛋白(hsp)70水平,评价OGD模型。方法利用PC12细胞,经NGF刺激诱导向神经细胞分化,利用OGD建立神经细胞OGD模型;利用MTT法、共聚焦显微镜鉴定PC12细胞转化为神经元样细胞及OGD模... 详细信息

目的探讨神经细胞氧糖剥夺(OGD)造模后PC12细胞凋亡和热休克蛋白(hsp)70水平,评价OGD模型。方法利用PC12细胞,经NGF刺激诱导向神经细胞分化,利用OGD建立神经细胞OGD模型;利用MTT法、共聚焦显微镜鉴定PC12细胞转化为神经元样细胞及OGD模型的建立,Western印迹检测OGD后Hsp70蛋白的表达。结果应用终浓度50 ng/ml NGF的DMEM完全培养基培养PC12细胞,随培养时间的增加细胞呈典型的神经元形态。微管相关蛋白(MAP)2免疫荧光细胞化学染色呈强阳性;建立OGD后神经元出现不同程度的损伤、坏死及凋亡,随OGD时间延长存活率逐渐降低、凋亡率升高、Hsp70蛋白表达增加。结论 NGF有效地诱导PC12细胞转化为神经细胞,OGD可以有效诱导hsp70表达。

关键词： PC12细胞氧糖剥夺 Hsp70蛋白

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仔猪Hsp70蛋白表达与断奶腹泻关系研究

东北农业大学学报 2011年第12期42卷 29-32,I0011页

作者：王莉汪蕊王希彪东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030

为了探讨hsp70在断奶过程中的作用,试验通过免疫组化方法检测民猪、长白猪断奶仔猪的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠六个组织中Hsp70蛋白的组织定位与定量变化。结果表明,胃肠道中Hsp70蛋白主要在黏膜上皮和肠腺内表达,在各组织... 详细信息

为了探讨hsp70在断奶过程中的作用,试验通过免疫组化方法检测民猪、长白猪断奶仔猪的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠六个组织中Hsp70蛋白的组织定位与定量变化。结果表明,胃肠道中Hsp70蛋白主要在黏膜上皮和肠腺内表达,在各组织内的表达没有因腹泻与否而发生组织定位的改变,在除胃以外的其他消化道组织中,长白健康组仔猪的Hsp70蛋白的表达量显著高于长白腹泻组、民猪健康与腹泻组。

关键词：猪断奶 Hsp70蛋白免疫组化

口咽鳞癌组织中HPV16感染和p16，Hsp70蛋白表达的临床意义

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口咽鳞癌组织中HPV16感染和p16，HSP70蛋白表达的临床意义

作者：崔湘凝中南大学

学位级别：硕士

目的：检测口咽鳞癌中HPV16感染及p16、Hsp70蛋白的表达,分析其临床意义,初步探讨HPV相关口咽癌对放疗敏感的分子机制。方法：选择中南大学湘雅医院病理科存档并满足入组条件的口咽鳞癌标本95例,同时收集病人的临床资料。采用原位... 详细信息

目的：检测口咽鳞癌中HPV16感染及p16、Hsp70蛋白的表达,分析其临床意义,初步探讨HPV相关口咽癌对放疗敏感的分子机制。方法：选择中南大学湘雅医院病理科存档并满足入组条件的口咽鳞癌标本95例,同时收集病人的临床资料。采用原位杂交法检测肿瘤组织中HPV16感染状况,通过免疫组化法检测p16、Hsp70蛋白的表达情况,分析三者的相关性,Western blot和单细胞克隆形成实验检测口咽鳞癌细胞HPV16下调后hsp70表达及放疗敏感性改变。采用SPSS17.0软件进行统计分析,总结p16蛋白阳性肿瘤的临床病理特点及预后,以总体生存率（OS）和无瘤生存率（DFS）作为观察指标,单因素分析采用Kaplan-Meier方法和log-rank检验,多因素分析采用Cox比例风险回归模型进行生存分析。结果：口咽鳞癌组织中HPV16感染率为48.3%,p16蛋白阳性率为52.6%, p16蛋白表达和HPV16感染存在显著相关性（P＜0.001）。单因素分析提示p16蛋白表达对口咽鳞癌病人预后有提示意义,P16蛋白阳性组3年总体生存率及无瘤生存率优于p16蛋白阴性组,总体生存率和无瘤生存率分别为70.4%对比40.0%（P=0.008）和63.0%对比25.7%（P=0.004）。无瘤生存率多因素分析提示,p16蛋白阴性病人死亡风险是p16蛋白阳性病人的2.36倍（HR0.432,95%CI0.201-0.891,P=0.024）,p16蛋白是影响无瘤生存率的独立预后因子。P16表达阴性的口咽鳞癌组织中Hsp70蛋白主要位于细胞浆,而p16表达阳性的癌组织中hsp70主要位于细胞膜,HPV16被有效靶向下调后hsp70表达上调,且细胞放疗敏感性降低。结论：口咽鳞癌病人HPV16感染率为48.3%,p16蛋白阳性表达率为52.6%,p16蛋白表达和HPV16感染存在显著相关性,可将p16作为HPV16感染状态比较理想的替代物,p16表达阳性的口咽鳞癌病人具有良好的生存优势,p16可能成为评估口咽鳞癌病人预后的重要指标,随HPV16下调后hsp70表达增加且放疗敏感性降低,提示hsp70下调可能是HPV相关口咽癌对放疗敏感的一个关键因素。图8幅,表5个,参考文献37篇

关键词：口咽鳞癌 HPV16 p16蛋白 Hsp70蛋白预后放疗敏感性

烟曲霉hsp70和HscA的抗原性、免疫原性及其潜在临床意义研究

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烟曲霉Hsp70和HscA的抗原性、免疫原性及其潜在临床意义研究

作者：鲁凡博安徽医科大学

学位级别：硕士

背景及目的：　　曲霉菌属是种广泛存在于自然环境中的机会性致病真菌，主要通过吸入的方式感染机体，由曲霉菌引起的侵袭性肺炎和血行播散性感染，称之为侵袭性肺曲霉病（Invasivepulmonaryaspergillosis，IPA）或侵袭性曲霉病（Invasi... 详细信息

背景及目的：　　曲霉菌属是种广泛存在于自然环境中的机会性致病真菌，主要通过吸入的方式感染机体，由曲霉菌引起的侵袭性肺炎和血行播散性感染，称之为侵袭性肺曲霉病（Invasivepulmonaryaspergillosis，IPA）或侵袭性曲霉病（Invasiveaspergillosis，IA），其中烟曲霉是临床最为常见的曲霉菌。IA是最致命的曲霉病，尽管真菌感染的治疗及护理手段已经取得了不小的进步，但IA死亡率仍居高不下。IA的高感染率和死亡率，决定了其早期诊断以及及时治疗的重要意义与价值，由于烟曲霉感染没有较为特异的临床特征，细菌/真菌培养需要一定周期，因此IA的早期诊断较为棘手，易被误诊。有研究显示，IA的误诊率可高达73%。近年有研究指出烟曲霉hsp70和HscA分布于菌体表面并有可能具有诱导保护性免疫反应或介导免疫逃避的抗原表位，故此本研究对hsp70和HscA的抗原性及免疫原性分别进行评估以探究其作为烟曲霉血清学检测候选抗原或疫苗靶点的潜力。　　方法：　　此次研究通过构建重组hsp70和HscA质粒并利用原核表达载体表达重组蛋白，然后利用镍离子凝胶亲和柱进行蛋白纯化，注射纯化后的hsp70和HscA于实验动物进行免疫。然后通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测临床烟曲霉感染的患者以及hsp70/HscA免疫后小鼠的血清/血浆中特异IgG抗体及其IgG亚型水平。此外，本研究利用体外试验，进一步探究经hsp70/HscA免疫后小鼠脾细胞的抗原特异性免疫应答和Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌模式。最后，利用流式细胞术探究经hsp70/HscA免疫后小鼠外周血/脾脏的淋巴细胞亚群分类特征等。　　结果：　　成功表达重组蛋白并免疫小鼠，经hsp70或HscA免疫后小鼠外周血中皆存在识别烟曲霉菌体蛋白IgG型抗体。另外，临床烟曲霉感染患者的hsp70特异性IgG水平高于未感染对照组（hsp70AUC=0.8400，cut-off值gt;1.089，敏感度为76.00%，特异度为86.67%）。hsp70免疫后小鼠的血浆中存在hsp70特异性IgG抗体，IgG亚型分析显示IgG1是其主要型别。Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子均有分泌。hsp70免疫后小鼠外周血/脾脏的B淋巴细胞百分比均低于对照组，而脾脏T淋巴细胞百分比高于对照组。同样地，烟曲霉感染患者中HscA特异性IgG水平显著地高于未感染的对照患者（HscAAUC=0.9867，cut-off值gt;1.008，敏感度为96.00%，特异度为100.00%）。经过HscA蛋白免疫后的小鼠宿主外周血中亦可检测到可观的针对HscA蛋白特异性IgG抗体，其IgG亚型也主要表现为IgG1型。该免疫小鼠体内亦存在Th1型、Th2型和Th17型的细胞因子分泌。经HscA免疫后该类小鼠外周血/脾脏的主要淋巴细胞亚群分类比例同对照组无显著性差异。　　结论：　　研究结果显示本研究中临床烟曲霉感染患者体内明确地存在针对烟曲霉hsp70与HscA的抗体;通过检测外周血烟曲霉hsp70和/或HscA抗体水平，在辅助判断宿主是否存在烟曲霉感染方面，具有较高的敏感度和特异度且HscA优于hsp70;实验结果显示此两种蛋白皆具有良好的抗原性及免疫原性，都可诱导Th1/Th2/Th17型细胞因子分泌和更好的细胞及体液免疫应答，包括高水平IgG1抗体的产生;提示hsp70/HscA具有成为诊断烟曲霉感染候选抗原及疫苗靶点的潜在价值。

关键词：烟曲霉 Hsp70蛋白 HscA蛋白抗原性免疫原性

Grb7蛋白和Hsp70蛋白在胃肠道间质瘤中的表达及临床意义

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中国实验诊断学 2013年第5期17卷 870-872页

作者：李培亮焦彦如王红山郑州人民医院医务科河南郑州450003 河南省职工医学院医学技术系河南郑州450003 郑州人民医院普外科

目的探讨Grb7和Hsp70蛋白在胃肠道间质瘤(GISTs)中的表达及其与GISTs生物学行为的关系,为预测该肿瘤的侵袭潜能提供理论依据和可能的预测指标。方法收集58例手术切除的GISTs标本,应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Grb7和Hsp70蛋白的表... 详细信息

目的探讨Grb7和Hsp70蛋白在胃肠道间质瘤(GISTs)中的表达及其与GISTs生物学行为的关系,为预测该肿瘤的侵袭潜能提供理论依据和可能的预测指标。方法收集58例手术切除的GISTs标本,应用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Grb7和Hsp70蛋白的表达,并结合病理形态学及生物学行为评价进行统计学分析。结果肿瘤组织中的Grb7和Hsp70蛋白阳性率分别为83.3%、67.24%,并随着GISTs恶性分级的增高,其表达均出现递增趋势,差异有显著性意义(PHsp70蛋白表达与GIST的发生、发展有关,检测P53、Grb7表达结合特殊病理学形态可以作为评价GISTs生物学行为及预后的客观指标。

关键词：胃肠道间质瘤 Grb7蛋白 Hsp70蛋白免疫组织化学方法

利用有机小分子研究Bim调控hsp70分子伴侣功能

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利用有机小分子研究Bim调控Hsp70分子伴侣功能

作者：潘皓大连理工大学

学位级别：硕士

蛋白质稳态是细胞能够正常发挥基本细胞功能所必须的,分子伴侣蛋白是蛋白质稳态的重要调控者,70 k Da的热休克蛋白（hsp70）是细胞中普遍存在的分子伴侣之一。从原核生物到真核生物,hsp70在广泛的细胞基本功能调节过程中发挥重要的作用... 详细信息

蛋白质稳态是细胞能够正常发挥基本细胞功能所必须的,分子伴侣蛋白是蛋白质稳态的重要调控者,70 k Da的热休克蛋白（hsp70）是细胞中普遍存在的分子伴侣之一。从原核生物到真核生物,hsp70在广泛的细胞基本功能调节过程中发挥重要的作用,例如新合成蛋白的折叠,多肽进入线粒体、叶绿体和内质网,蛋白质复合物的分解和蛋白质活性的调节。hsp70的分子伴侣功能需要辅伴侣蛋白的调控来完成。hsp70拥有众多的辅伴侣蛋白,包含J protein家族蛋白和NEF家族蛋白。本课题组首次报道了BH3-only蛋白Bim能够作为hsp70的辅伴侣蛋白。Bim通过BH3结构域与hsp70结合,稳定hsp70的ATP构像,提高了hsp70的ATPase活性。一直以来,Bim被认为是凋亡激活因子:一方面Bim可以直接激活Bcl-2促凋亡成员Bax/Bak,另一方面还能拮抗抗凋亡的Bcl-2/Mcl-1蛋白。因此在哺乳动物细胞中,Bim通过调控hsp70促进细胞生存的这一功能受到Bcl-2家族蛋白的干扰导致研究比较困难。酵母中没有Bcl-2家族同源蛋白,Bim可以在酵母中外源表达并且保持活性,又不能发挥其促凋亡功能,因此酿酒酵母是非常适合研究Bim的促生存功能的简单模型。另外,小分子具有结构简单,功能清晰,靶标单一等优点,是研究蛋白质功能的理想工具。本课题组已经研发的第一个hsp70/Bim的小分子抑制剂S1g-6（2-（6-环己基硫基-2-氰基-1-氧-1H-非那烯基氨基）乙基吗啉）,能够直接地、特异性地结合在Bim在hsp70表面的结合位点,是研究Bim作为辅助伴侣蛋白调控hsp70功能的分子工具。本论文首先表达纯化重组的Hsc70蛋白和J protein蛋白用于体外研究Bim对hsp70的调控,通过酶活实验以及底物热变性实验,证明了Bim在体外正向调控hsp70的分子伴侣功能,通过刺激hsp70的ATPase活性来发挥辅伴侣功能。之后,将Bim转化的酵母菌株在S1g-6处理下,通过检测酵母的生长曲线,从酵母生长表型上初步证明了外源蛋白Bim的转入促进了酵母的生长,而S1g-6抑制了酵母的生长。免疫共沉淀hsp70,Western blot检测hsp70和Bim的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim通过结合酵母中hsp70促进了酵母的生长,而S1g-6通过解离这一相互作用抑制酵母的生长。在热应激处理条件下,通过检测酵母生长曲线、Western blot检测hsp70和底物蛋白的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim提高了酵母的耐热能力及热应激恢复能力。证实了Bim在酵母中发挥正向的辅伴侣作用,促进了hsp70的分子伴侣功能,展现了Bim的促生存功能。另外,通过串联质谱标签技术（TMT技术）鉴定一系列Bim调控的hsp70的互作蛋白以及通过S1g-6解离hsp70/Bim二聚体所调控的hsp70的互作蛋白,将差异蛋白进行GO富集分析,进一步证实了Bim通过正向调控酵母中hsp70的功能来促进酵母的生长,在一定程度上揭示了Bim的促生存功能。综上所述,本论文证明了一定浓度的Bim在体外不同温度条件下对hsp70分子伴侣功能的正向调控作用,以及在无Bcl-2家族蛋白干扰的酵母细胞中证明了Bim的促生存功能,为进一步在哺乳动物细胞中研究Bim这一新的hsp70辅伴侣蛋白提供了研究方向。

关键词： Hsp70蛋白 Bim 酵母小分子抑制剂

声刺激对斜带石斑鱼血清酶活力及肝组织hsp70表达量、病理变化的影响

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大连海洋大学学报 2019年第3期34卷 331-337页

作者：林海霞王湘文孙省利广东海洋大学水产学院广东湛江524088 海洋资源与环境监测中心广东湛江524088 广东海洋大学化学与环境学院广东湛江524088

为研究声刺激对斜带石斑鱼Epinephelus coioides生理生化的影响,以体质量为(42.54±6.03)g、体长为(13.26±0.78)cm的斜带石斑鱼为研究对象,将其暴露于正弦波纯音[600 Hz,130 dB(re 1μPa)]信号下,分别在声刺激0 (对照)、2、6、12、24... 详细信息

为研究声刺激对斜带石斑鱼Epinephelus coioides生理生化的影响,以体质量为(42.54±6.03)g、体长为(13.26±0.78)cm的斜带石斑鱼为研究对象,将其暴露于正弦波纯音[600 Hz,130 dB(re 1μPa)]信号下,分别在声刺激0 (对照)、2、6、12、24、72、120 h时测定斜带石斑鱼血清中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)活力及肝脏中热休克蛋白70(hsp70)表达量的变化,并对肝脏组织进行病理染色检测分析。结果表明:在试验周期内,斜带石斑鱼无死亡现象;声刺激0～120 h内,斜带石斑鱼血清中ACP酶活力呈现先降低后升高再恢复至初始(0 h)水平的变化趋势,AKP酶活力总体呈现先下降后恢复至初始水平的变化趋势,ACP酶活力在声刺激24 h时达到最高值(15.04 U/100 mL)(P0.05);GOT和GPT酶活力均呈现先升高后下降最后恢复至初始水平的变化趋势,GOT和GPT酶活力分别在6、12 h时达到最高水平(P0.05);Western Blot检测显示,声刺激后斜带石斑鱼肝脏中hsp70表达量均有所升高,声刺激12 h时hsp70表达量最高(P<0.05);肝组织切片观察结果显示,声刺激后斜带石斑鱼肝细胞胞质内脂质含量增加,细胞多呈空泡状,在试验后期,肝细胞出现肝窦间隙增大,肝板消失,细胞核偏移甚至消失等变化,12、48、72 h时有红细胞聚集现象,但肝细胞均未见明显的坏死、炎症和纤维化等病理改变。研究表明,声刺激会导致斜带石斑鱼产生应激反应,且生理生化指标的变化具有一定时间效应。

关键词：斜带石斑鱼正弦波肝脏组织 Hsp70蛋白