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鼻咽癌细胞株侧群细胞染色条件的优化及其表面标记物的测定

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第三军医大学学报 2010年第5期32卷 499-501页

作者：焦锋邱际华张千兵姚开泰刘求真南方医科大学肿瘤研究所广州510515

目的探讨鼻咽癌细胞株侧群细胞所需荧光染料Hoechst33342最佳的孵育时间和浓度;研究细胞密度对侧群细胞比例的影响;测定其表面标记物CD133和ABCG2蛋白的表达。方法荧光染料Hoechst33342孵育细胞,选择不同的时间(30、60、90、120、150、1... 详细信息

目的探讨鼻咽癌细胞株侧群细胞所需荧光染料Hoechst33342最佳的孵育时间和浓度;研究细胞密度对侧群细胞比例的影响;测定其表面标记物CD133和ABCG2蛋白的表达。方法荧光染料Hoechst33342孵育细胞,选择不同的时间(30、60、90、120、150、180min)及不同的浓度(3、4、5、6、7、8mg/L),用流式细胞仪检测,倒置荧光显微镜观察选择合适的孵育时间和浓度。选取不同生长密度(70%、100%)的细胞,流式细胞仪检测侧群细胞比例的变化。荧光抗体CD133和ABCG2共孵育Hoechst33342,流式细胞仪测定细胞表面标记物CD133和ABCG2蛋白的表达。结果Hoechst33342孵育时间为70min,侧群细胞染色效果较佳。不同的鼻咽癌细胞株,合适孵育终浓度不同,如CNE2为6mg/L,而CNE1为2mg/L。另外,侧群细胞的比例呈生长密度依赖性。CD133蛋白总含量恒定在0.1%～0.2%,侧群细胞和主群细胞表达量没有显著差异,CD133并不富集于侧群细胞中。而侧群细胞ABCG2蛋白较主群细胞优势表达,比例达80%以上。结论鼻咽癌细胞株侧群细胞最佳的荧光染料染色时间为70min,不同细胞株孵育终浓度不同。侧群细胞的比例呈密度依赖,与ABCG2密切相关。

关键词：侧群细胞主群细胞肿瘤干细胞流式细胞术 Hoechst33342 鼻咽肿瘤

肝癌中少量侧群细胞的分离、纯化及在体内荷瘤能力

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第二军医大学学报 2011年第10期32卷 1126-1130页

作者：王鑫何雅琴杨文王红阳第二军医大学东方肝胆外科研究所国际合作信号转导研究中心上海200438

目的从侧群(side population,SP)表型细胞具有干细胞特性的角度出发,对肝癌细胞系中的SP细胞进行检测、分离和评价。方法利用SP细胞能将荧光染料Hoechst33342泵到细胞外的特性,结合流式细胞技术进行分离纯化。结果在肝癌细胞系PLC、Huh7... 详细信息

目的从侧群(side population,SP)表型细胞具有干细胞特性的角度出发,对肝癌细胞系中的SP细胞进行检测、分离和评价。方法利用SP细胞能将荧光染料Hoechst33342泵到细胞外的特性,结合流式细胞技术进行分离纯化。结果在肝癌细胞系PLC、Huh7、Hep3B、SMMC7721及1例临床肝癌组织中检测到SP细胞的比例依次为0.8%、0.3%、0.6%、0.3%、0.4%;未在HepG2中检测到SP细胞。NOD-SCID荷瘤实验发现SP细胞较非SP细胞具有更高的成瘤性。结论肝癌细胞系及标本组织含有少量的SP细胞,这些SP细胞比非SP细胞具有更强的成瘤性,为进一步分析SP细胞的肿瘤干细胞特性奠定了基础。

关键词：肝肿瘤肝细胞癌肿瘤干细胞侧群细胞肿瘤发生 Hoechst33342

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凋亡精子DNA两种染色法的比较

中华男科学杂志 2005年第2期11卷 101-103页

作者：余文辉李卓华杨为民李光昭周小梅李康生深圳市中医院检验科广东深圳518033 汕头市第二人民医院妇产科广东汕头515011 汕头市第二人民医院泌尿外科广东汕头515011 汕头大学医学院免疫与微生物学教研室广东汕头515031

　目的:对荧光素Hoechst33342和Hoechst33342/碘化丙啶(PI)两种评价精子质量的染色法进行比较分析。方法:将已分离提取的精子悬液与DNA拓扑异构酶抑制剂浓度为0、0.15、15μmol/L喜树碱(CAM)或浓度为0.37、 3.7mmol/Lgenistein(GEN... 详细信息

　目的:对荧光素Hoechst33342和Hoechst33342/碘化丙啶(PI)两种评价精子质量的染色法进行比较分析。方法:将已分离提取的精子悬液与DNA拓扑异构酶抑制剂浓度为0、0.15、15μmol/L喜树碱(CAM)或浓度为0.37、 3.7mmol/Lgenistein(GEN)混合后,置37℃孵育4h。通过hoechst3342单染或hoechst3342/PI复染,荧光显微镜检查,对具独立细胞周期的凋亡和坏死精子进行分析,以比较这两种染色方法的效果。　结果:单染法不能区分精子活率;复染法能鉴定经不同剂量CAM和GEN处理后精子活率下降程度和坏死精子的增加量。CAM和GEN处理可使凋亡精子数量增多两倍。　结论:精子凋亡和剂量依赖性坏死增多与两种拓扑异构酶抑制剂相关。Ho echst33342/PI复染比Hoechst33342单染法对精子的分析敏感度更高,并可对精子坏死和凋亡作出定量分析。

关键词：精子凋亡坏死 Hoechst33342 碘化丙啶 DNA拓扑异构酶

Huh7细胞中边缘群细胞分选及其增殖分裂能力的研究

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Huh7细胞中边缘群细胞分选及其增殖分裂能力的研究

作者：丁景弦南京医科大学

学位级别：硕士

研究背景: 恶性肿瘤给人类的生存构成严重的威胁,现有治疗措施几乎都不能改变晚期恶性肿瘤复发并最终导致患者死亡的现状。由于肿瘤的侵袭以及长期治疗导致耐药仍然是当前攻克恶性肿瘤的主要障碍,因此,阐明肿瘤耐药的分子机制具有重大... 详细信息

研究背景: 恶性肿瘤给人类的生存构成严重的威胁,现有治疗措施几乎都不能改变晚期恶性肿瘤复发并最终导致患者死亡的现状。由于肿瘤的侵袭以及长期治疗导致耐药仍然是当前攻克恶性肿瘤的主要障碍,因此,阐明肿瘤耐药的分子机制具有重大的理论意义及临床应用价值。肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量干细胞样肿瘤细胞亚群,它们具有无限增殖的潜能,在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用,而其余的大多数细胞,经过短暂的分化,最终死亡。肿瘤干细胞是造成肿瘤耐药的最根本原因,其对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。目前鉴定肿瘤干细胞主要有检测其特异性表面抗原标志物及检测边缘群细胞( side population, SP)两种方法。本研究试图探讨肝癌细胞株Huh7细胞中边缘群细胞的分选及其增值分裂能力,为肝癌的靶向治疗提供新的思路。研究目的: 探讨Huh7细胞中边缘群细胞的分选及边缘群细胞在增值能力及分裂能力方面与非边缘群细胞的差异,为肝癌的治疗探索新的思路。研究方法: 1.细胞培养: Huh7细胞常规培养于10%FBS DMEM培养基中。 2.单细胞悬液的制备:对数生长期细胞常规胰酶消化后吹打均匀,调整细胞密度为2～3×10/L(细胞计数板计数),部分细胞悬液先加150μmol/L维拉帕米37℃孵育20min作对照组,实验组和对照组均加入10μg/ml Hoechst33342在水浴锅中37℃避光孵育90min,每15min低速震荡摇匀一次,用10 mmol/L HEPES、10%FBS Hank’s液洗涤3次(离心力800转/min,5min/次),后置冰上,分选前经40μm孔径的滤网过滤制备成单细胞悬液,分选前5min加入P I至终浓度为2μg/ml。 3.采用流式细胞仪分选Huh7细胞中的边缘群细胞和非边缘群细胞。 4.利用荧光显微镜观察边缘群细胞和非边缘群细胞内Hoechst33342荧光染色强度差异。 5.以半定量RT-PCR测定边缘群细胞和非边缘群细胞ABCG2 mRNA表达水平,ABCG2 PCR产物送公司测序,GAPDH为内参。 6.免疫荧光染色检测边缘群细胞和非边缘群细胞ABCG2蛋白表达的差异并观察其增值能力和不对称分裂能力的差异。研究结果: 1.Huh7细胞经流式细胞仪分选发现非维拉帕米处理组边缘群细胞比例约为2.22% ,经维拉帕米阻断后边缘群细胞比例减少至0.74%。 2.荧光显微镜下观察发现边缘群细胞中Hoechst33342的荧光强度较非边缘群细胞明显弱。 3.ABCG2 mRNA表达水平在边缘群细胞中是非边缘群细胞的4.32倍(P<0.01)。 4.边缘群细胞增值能力是非边缘群细胞的2.7倍(P<0.01)。 5.边缘群细胞能产生ABCG2(+)和ABCG2(-)子代细胞,而非边缘群细胞只能产生ABCG2(-)子代细胞。研究结论: Huh7细胞中存在少量边缘群细胞(2.22%),边缘群细胞增值能力较非边缘群细胞强且具有不对称分裂(自我更新和定向分化)能力,具有肿瘤干细胞的特性;因此边缘群细胞分选可以作为肿瘤干细胞分离的一种方法,边缘群细胞可能在肿瘤的形成、进展、耐药及复发转移中具有更重要作用。

关键词：肝癌边缘群细胞维拉帕米 Hoechst33342 ABCG2

盘基网柄菌发育期间蛞蝓体的形态学以及类免疫细胞的研究

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盘基网柄菌发育期间蛞蝓体的形态学以及类免疫细胞的研究

作者：李丽华东师范大学

学位级别：硕士

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)隶属原生动物,是一类社会阿米巴虫,当生长条件良好时,细胞会以二分裂方式来繁殖后代;当生存环境恶劣时,进行多细胞发育,整个发育过程约需24 h,大致分4个阶段：细胞聚集(aggregation)阶段、细胞丘(m... 详细信息

盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)隶属原生动物,是一类社会阿米巴虫,当生长条件良好时,细胞会以二分裂方式来繁殖后代;当生存环境恶劣时,进行多细胞发育,整个发育过程约需24 h,大致分4个阶段：细胞聚集(aggregation)阶段、细胞丘(mound)阶段、蛞蝓体(slug)阶段和子实体(fruiting body)阶段。蛞蝓体可细分为“突起”时期、“蛞蝓”时期和“拔顶”时期。蛞蝓体阶段的细胞分为前柄细胞和前孢子细胞两大类,前柄细胞又可分PstA细胞、PstB细胞、PstO细胞和PstAB细胞;前孢子细胞只有Psp细胞。到子实体阶段前柄细胞发育成柄细胞,前孢子细胞发育成孢子细胞,一旦条件合适,孢子细胞萌发开始新生命周期,而柄细胞无论在什么条件下都不能萌发,因此柄细胞是凋亡细胞。可见,盘基网柄菌细胞发育和高等生物发育相似,同样存在着细胞分化和细胞凋亡现象。蛞蝓体时期是细胞分化和细胞开始衰退的起始阶段。由于受到环境影响及其个体大小存在差异,蛞蝓体的个体发育的并不是完全同步的,但整个蛞蝓体阶段只有两个小时,故以往都把蛞蝓体看成一个时期,蛞蝓体具体的形态发育过程却未见报道。由于各类细胞运动速度不同,蛞蝓体形态发生了巨大的变化。本工作用吖啶橙(Acridine orange,AO)和hoechst 33342(HO)两种活体荧光染料,在盘基网柄菌细胞发育活体状态下,通过荧光显微镜观察盘基网柄菌细胞的分化情况,以期了解盘基网柄菌细胞发育,特别是蛞蝓体发育的具体过程及发育过程中出现的细胞分化及凋亡情况。结果发现：占整个蛞蝓体近4／5细胞的细胞核在整个发育过程中始终都染成蓝色,细胞未见衰退迹象,因此最终发育成孢子细胞。这与孢子细胞能够萌发,形成新的生命体是相符合的。而位于蛞蝓体前部,占整个蛞蝓体1／5细胞的细胞核随着发育进程,细胞核先被染成蓝绿色,然后被染成绿色,再成橙色,直到最后显不出颜色。发育至蛞蝓体后期时,在蛞蝓体内部可看到一“通道”,“通道”内部被染成绿色,在发育成子实体时候,在“通道”内部可见浅蓝绿色的网状结构,并且蛞蝓体时期的“通道”位置与子实体时期的柄的位置一致,由此推测,子实体的柄极有可能是“通道”发育而来的。这些数据提示从蛞蝓体前期开始,前柄细胞就已经开始凋亡,但细胞并不是马上死亡而是一个渐进的凋亡过程,细胞核的功能一开始并不是完全消失,而是随着细胞凋亡进程,逐渐丧失其功能,前柄细胞彻底凋亡后其细胞核才彻底丧失。因此按照染色的结果来看,蛞蝓体前柄细胞发育至少可分成4个时期,蓝绿色期、绿色期、橙色期和无色期。因此可以通过细胞核着色不同,来了解具体形态发育过程及其细胞的衰退程度,这为以后研究盘基网柄菌的发育提供依据。在实验过程中,笔者发现当Hoechst33342的浓度高于10μgmL时,不再仅仅染活细胞的细胞核,会引起细胞死亡或引起细胞发生某些应急反应,即对盘基网柄菌产生毒性效应。在蛞蝓体阶段会出现一类吞噬Hoechst33342有毒物质的细胞。这类有特殊的功能细胞与高等生物的的免疫细胞功能相似,也有解毒和免疫样活性,笔者称之为类免疫细胞。为了进一步验证类免疫细胞的存在,实验中用荧光染料EB作为盘基网柄菌生长环境中所遇毒物的替代品,通过荧光显微镜观察,激光共聚焦显微镜观察定位以及流式细胞仪来确定类免疫细胞的所处细胞群及其所占细胞比例。已知EB除了有毒外还可以穿过受损细胞膜对细胞核着色,我们先通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察定位实验后发现,EB并不是定位在细胞核中,因而说明其不是与DNA结合而显色的,而是被包裹在细胞内。通过荧光显微镜观察研究发现类免疫细胞不但能吞噬EB,·把EB包裹在类免疫细胞中,防止对蛞蝓体的毒害,而且发现随着蛞蝓体移动,含EB的细胞团留在遗弃的粘液鞘中,最终将毒物脱出体外。表明在动物进化到多细胞之前,有觅食功能的单细胞低等真核生物已经具备有防御能力。通过流式细胞仪的检测结果发现,这些类免疫细胞主要来自于前柄细胞,猜想是前柄细胞中的一类特殊细胞。目前我们只是在形态上和来源上对这些细胞进行了研究,但对这类类免疫细胞的免疫相关蛋白,类免疫细胞是在毒物诱导后产生还是毒物诱导前就已经存在的,在毒物被排除后,类免疫细胞是否仍然存在等问题,还需要从分子方面做进一步研究。

关键词：盘基网柄菌蛞蝓体吖啶橙 Hoechst33342 PI 类免疫细胞

甘精胰岛素干预游离脂肪酸诱导RIN-m细胞凋亡的变化

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中国临床康复 2005年第15期9卷 94-96,i002页

作者：傅静奕李焱严励张淼陈黎红傅祖植中山大学附属第二医院内分泌科广东省广州市510120

目的:观察甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的β细胞(RIN-m细胞)凋亡是否具有保护作用,并与普通胰岛素及胰岛素样生长因子1的干预效果进行对比。方法:本实验于2004-05/2004-10在中山大学附属第二医院林百欣医学科学研究中心完成。RIN-m细胞... 详细信息

目的:观察甘精胰岛素对游离脂肪酸诱导的β细胞(RIN-m细胞)凋亡是否具有保护作用,并与普通胰岛素及胰岛素样生长因子1的干预效果进行对比。方法:本实验于2004-05/2004-10在中山大学附属第二医院林百欣医学科学研究中心完成。RIN-m细胞被培养并常规培养传代。诱导凋亡接种于6孔板或者96孔板后常规培养2d,待细胞长至70%满左右时,吸去培养基,加入含10g/L血清白蛋白,10mL/L乙醇,20mL/L胎牛血清的培养基(正常对照组),或者含10g/L血清白蛋白,体积分数为0.01乙醇、体积分数为0.02胎牛血清和0.3mmol/L棕榈酸的培养基(凋亡对照组),或者含10g/L牛血清白蛋白,体积分数为0.01乙醇、体积分数为0.02胎牛血清,0.3mmol/L棕榈酸以及100nmol/L甘精胰岛素(甘精胰岛素组)或者100nmol/L普通胰岛素(普通胰岛素组)或者10nmol/L胰岛素样生长因子1组的培养基,孵育24h后,将细胞接种于6孔板,诱导细胞凋亡。采用Hoechst33342染色、流式细胞仪以及酶联免疫吸附反应方法检测各组RIN-m细胞的凋亡,吸光度值代表细胞裂解液中核小体的数量,即DNA断裂的数量。结果:0.3mmol/L棕榈酸孵育后RIN-m细胞出现核皱缩、碎裂等典型凋亡表现。①甘精胰岛素组、普通胰岛素组、胰岛素样生长因子1组亚二倍体细胞比率(32.00±3.08)%,(35.97±3.14)%,(25.25?

关键词：甘精胰岛素游离脂肪酸胰岛素样生长因子1 Hoechst33342 中山大学附属第二医院普通胰岛素 mol/L 医学科学研究中心酶联免疫吸附反应正常对照组细胞裂解液体积分数胎牛血清牛血清白蛋白诱导细胞凋亡流式细胞仪

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侧群细胞与肿瘤干细胞研究进展

中华肿瘤防治杂志 2008年第24期15卷 1914-1918页

作者：钟永张叔人中国医学科学院北京协和医学院肿瘤研究所免疫室北京100021

目的:总结国内外采用侧群细胞分析法(side populations analysis)研究肿瘤干细胞的现状。方法:应用检索PubMed数据库检索系统,以"侧群细胞"和"肿瘤干细胞"等为关键词,检索1996-01-2008-12侧群细胞法研究肿瘤干细胞的文献。资料选择:选... 详细信息

目的:总结国内外采用侧群细胞分析法(side populations analysis)研究肿瘤干细胞的现状。方法:应用检索PubMed数据库检索系统,以"侧群细胞"和"肿瘤干细胞"等为关键词,检索1996-01-2008-12侧群细胞法研究肿瘤干细胞的文献。资料选择:选择所有侧群细胞法研究肿瘤干细胞的文献。纳入标准:1)侧群细胞法分离肿瘤干细胞;2)侧群细胞法鉴定肿瘤干细胞。根据纳入标准,精选80篇文献,最后纳入分析36篇文献。结果:采用SP法可以有效的分离和富集大部分类型的肿瘤干细胞,但是某些肿瘤SP细胞不具有肿瘤干细胞特性,此外,SP法还存在细胞毒性的问题。结论:采用SP分析法研究肿瘤干细胞存在许多问题,但是当无法确认到某种类型的肿瘤干细胞的表面标志时,它仍然是分离和富集肿瘤干细胞的有效方法之一。

关键词：侧群细胞肿瘤干细胞 Hoechst33342

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几种材料引起细胞自噬的相关生物学功能研究

几种材料引起细胞自噬的相关生物学功能研究

作者：孙轲婧中国科学技术大学

学位级别：硕士

细胞自噬是一种与溶酶体相关的降解细胞内物质的动态过程,近年来因其在很多发育和疾病过程中起着重要作用而受到极大关注。细胞自噬的作用可以是细胞保护性的,也可以是促进细胞死亡的。需要对细胞自噬有更好的了解以用于治疗的目的,而... 详细信息

细胞自噬是一种与溶酶体相关的降解细胞内物质的动态过程,近年来因其在很多发育和疾病过程中起着重要作用而受到极大关注。细胞自噬的作用可以是细胞保护性的,也可以是促进细胞死亡的。需要对细胞自噬有更好的了解以用于治疗的目的,而事实上对细胞自噬分子机制的更深入了解已经帮助找到很多激动人心的潜在药物靶点。这里,主要介绍了课题组关于细胞自噬的多项研究工作中的两项。在前一部分中,通过将不溶于水的纳米富勒烯及其衍生物粉末稳定分散于水中形成纳米晶体,证明这一系列纳米富勒烯及衍生物能够引起细胞自噬。同时,这种自噬过程在受到光照刺激后有所增强,并且该反应依赖于自由基。通过课题组成员的进一步研究发现,能引起细胞自噬剂量的纳米C60不会引起细胞死亡,但能增强化疗药物杀死癌细胞（包括耐药性癌细胞）的效应,且这一过程需要Atg5这个自噬必须基因的参与。这为开发合适的水溶性纳米富勒烯衍生物,进一步拓宽富勒烯及其衍生物通过自噬途径在相关生物和医药领域中发挥作用提供了理论前提。在后一部分中,研究发现一种拓扑异构酶抑制剂Hoechst33342可以在HeLa细胞中强烈诱导细胞自噬,并且这种自噬过程可以保护细胞以拮抗HO诱导的凋亡。值得注意的是,用细胞自噬抑制剂和HO共同处理可以大幅度增强HO抑制肿瘤细胞的作用。总之,这两项新颖的工作都以细胞自噬为靶点开发化疗药物为目的进行了有益的探索,具有重要价值。

关键词：细胞自噬细胞凋亡富勒烯衍生物 C60 C60Cl6 C60ph6 Hoechst33342

肌苷减少高浓度锌损伤的PC12细胞坏死而不是凋亡(英文)

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神经科学通报 2005年第2期21卷 158-164页

作者：史明郑春霞游思维第四军医大学神经科学研究所陕西西安710032

目的　探讨高浓度锌损伤后PC12细胞的死亡类型和肌苷对该死亡类型的影响。方法　用MTT比色法测定不同浓度氯化锌(50、100、200、400μmol/L)或肌苷(0. 1、0. 5、1. 0、2. 0mmol/L)作用PC12细胞12h后的存活率;用Hoechst33342 /PI荧光双... 详细信息

目的　探讨高浓度锌损伤后PC12细胞的死亡类型和肌苷对该死亡类型的影响。方法　用MTT比色法测定不同浓度氯化锌(50、100、200、400μmol/L)或肌苷(0. 1、0. 5、1. 0、2. 0mmol/L)作用PC12细胞12h后的存活率;用Hoechst33342 /PI荧光双染色、Annexin V结合实验及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法检测200μmol/L氯化锌、2. 0mmol/L肌苷作用PC12细胞12h后细胞死亡类型的变化。结果　锌从100μmol/L作用浓度开始可明显降低细胞存活率; 200μmol/L锌可引起(56. 5±7. 2 )%坏死、(24. 4±2. 5 )%的正常和(19. 1±7. 6 )%的细胞凋亡。肌苷从0. 5mmol/L作用浓度开始可显著提高锌损伤的细胞存活率;与单独锌作用相比, 2. 0mmol/L肌苷降低锌引起的坏死细胞数至(27. 9±2. 2)%,而使正常和凋亡细胞数分别增加到(33. 8±2. 8)%和(38. 4±4. 9)%。结论　随锌浓度的增高PC12细胞的存活率逐渐降低,肌苷可浓度依赖性地保护锌致伤的PC12细胞;高浓度锌可造成PC12细胞的坏死和凋亡,但肌苷能降低坏死而不是使细胞凋亡。

关键词：肌苷细胞坏死损伤 Hoechst33342 PC12细胞 DNA琼脂糖凝胶电泳 mol/L Annexin 细胞存活率死亡类型细胞凋亡比色法测定浓度依赖性不同浓度氯化锌细胞数 MTT 双染色锌浓度