盘基网柄菌发育期间蛞蝓体的形态学以及类免疫细胞的研究

作     者：李丽 

作者单位：华东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：侯连生

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071002[理学-动物学] 

主      题：盘基网柄菌 蛞蝓体 吖啶橙 Hoechst33342 PI 类免疫细胞 

摘      要：盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)隶属原生动物,是一类社会阿米巴虫,当生长条件良好时,细胞会以二分裂方式来繁殖后代;当生存环境恶劣时,进行多细胞发育,整个发育过程约需24 h,大致分4个阶段：细胞聚集(aggregation)阶段、细胞丘(mound)阶段、蛞蝓体(slug)阶段和子实体(fruiting body)阶段。蛞蝓体可细分为“突起时期、“蛞蝓时期和“拔顶时期。蛞蝓体阶段的细胞分为前柄细胞和前孢子细胞两大类,前柄细胞又可分PstA细胞、PstB细胞、PstO细胞和PstAB细胞;前孢子细胞只有Psp细胞。到子实体阶段前柄细胞发育成柄细胞,前孢子细胞发育成孢子细胞,一旦条件合适,孢子细胞萌发开始新生命周期,而柄细胞无论在什么条件下都不能萌发,因此柄细胞是凋亡细胞。可见,盘基网柄菌细胞发育和高等生物发育相似,同样存在着细胞分化和细胞凋亡现象。蛞蝓体时期是细胞分化和细胞开始衰退的起始阶段。由于受到环境影响及其个体大小存在差异,蛞蝓体的个体发育的并不是完全同步的,但整个蛞蝓体阶段只有两个小时,故以往都把蛞蝓体看成一个时期,蛞蝓体具体的形态发育过程却未见报道。由于各类细胞运动速度不同,蛞蝓体形态发生了巨大的变化。本工作用吖啶橙(Acridine orange,AO)和Hoechst 33342(HO)两种活体荧光染料,在盘基网柄菌细胞发育活体状态下,通过荧光显微镜观察盘基网柄菌细胞的分化情况,以期了解盘基网柄菌细胞发育,特别是蛞蝓体发育的具体过程及发育过程中出现的细胞分化及凋亡情况。结果发现：占整个蛞蝓体近4／5细胞的细胞核在整个发育过程中始终都染成蓝色,细胞未见衰退迹象,因此最终发育成孢子细胞。这与孢子细胞能够萌发,形成新的生命体是相符合的。而位于蛞蝓体前部,占整个蛞蝓体1／5细胞的细胞核随着发育进程,细胞核先被染成蓝绿色,然后被染成绿色,再成橙色,直到最后显不出颜色。发育至蛞蝓体后期时,在蛞蝓体内部可看到一“通道,“通道内部被染成绿色,在发育成子实体时候,在“通道内部可见浅蓝绿色的网状结构,并且蛞蝓体时期的“通道位置与子实体时期的柄的位置一致,由此推测,子实体的柄极有可能是“通道发育而来的。这些数据提示从蛞蝓体前期开始,前柄细胞就已经开始凋亡,但细胞并不是马上死亡而是一个渐进的凋亡过程,细胞核的功能一开始并不是完全消失,而是随着细胞凋亡进程,逐渐丧失其功能,前柄细胞彻底凋亡后其细胞核才彻底丧失。因此按照染色的结果来看,蛞蝓体前柄细胞发育至少可分成4个时期,蓝绿色期、绿色期、橙色期和无色期。因此可以通过细胞核着色不同,来了解具体形态发育过程及其细胞的衰退程度,这为以后研究盘基网柄菌的发育提供依据。在实验过程中,笔者发现当Hoechst33342的浓度高于10μgmL时,不再仅仅染活细胞的细胞核,会引起细胞死亡或引起细胞发生某些应急反应,即对盘基网柄菌产生毒性效应。在蛞蝓体阶段会出现一类吞噬Hoechst33342有毒物质的细胞。这类有特殊的功能细胞与高等生物的的免疫细胞功能相似,也有解毒和免疫样活性,笔者称之为类免疫细胞。为了进一步验证类免疫细胞的存在,实验中用荧光染料EB作为盘基网柄菌生长环境中所遇毒物的替代品,通过荧光显微镜观察,激光共聚焦显微镜观察定位以及流式细胞仪来确定类免疫细胞的所处细胞群及其所占细胞比例。已知EB除了有毒外还可以穿过受损细胞膜对细胞核着色,我们先通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察定位实验后发现,EB并不是定位在细胞核中,因而说明其不是与DNA结合而显色的,而是被包裹在细胞内。通过荧光显微镜观察研究发现类免疫细胞不但能吞噬EB,·把EB包裹在类免疫细胞中,防止对蛞蝓体的毒害,而且发现随着蛞蝓体移动,含EB的细胞团留在遗弃的粘液鞘中,最终将毒物脱出体外。表明在动物进化到多细胞之前,有觅食功能的单细胞低等真核生物已经具备有防御能力。通过流式细胞仪的检测结果发现,这些类免疫细胞主要来自于前柄细胞,猜想是前柄细胞中的一类特殊细胞。目前我们只是在形态上和来源上对这些细胞进行了研究,但对这类类免疫细胞的免疫相关蛋白,类免疫细胞是在毒物诱导后产生还是毒物诱导前就已经存在的,在毒物被排除后,类免疫细胞是否仍然存在等问题,还需要从分子方面做进一步研究。