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大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47相互作用蛋白his-pull down和质谱鉴定

海洋与湖沼 2021年第4期52卷 971-982页

作者：朱春月孙志宾马爱军刘志峰杨敬昆赵亭亭上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室山东省海洋渔业生物技术与遗传育种重点实验室青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室青岛266237

首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达... 详细信息

首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达,表达量最高的组织是肝脏,表达量最低组织是鳃;25℃处理6 h后SmHsp47在皮肤中的表达量增加150多倍。利用大肠杆菌原核表达系统表达了SmHsp47的his标签融合蛋白,然后利用his-pull down技术捕获了SmHsp47的相互作用蛋白质,通过质谱分析鉴定出31种候选蛋白,其中大部分蛋白为参与翻译后修饰,蛋白转换及分子伴侣;此外还包括参与脂转运与代谢、能量产生与转换、细胞骨架、防御机制等过程的蛋白质。从31种候选蛋白中进一步筛选出3种分值较高的蛋白:未知蛋白(uncharacterized protein,A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B(Fetuin B,A0A2U9C388)和胶原结合蛋白(collagen-binding protein,A0A2U9B608),可为后续的研究提供方向。

关键词：大菱鲆(Scophthalmus maximus) SmHsp47 蛋白相互作用 his-pull down

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十二指肠贾第虫Rab11互作蛋白的筛选

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中国病原生物学杂志 2024年第1期19卷 25-31页

作者：高梦遥赵志腾李璐张西臣王晓岑李新张楠宫鹏涛吉林大学动物医学学院吉林长春130062

目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法通过分子克隆技术构建含his标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,... 详细信息

目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法通过分子克隆技术构建含his标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,获得Rab11融合蛋白(rGdRab11)。用该蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以此为抗体采用免疫荧光法观察Rab11蛋白的亚细胞定位。应用his-pull down联合质谱技术筛选贾第虫全虫蛋白中与Rab11蛋白互作的候选蛋白,并在GiardiaDB数据库和Revigo中对筛选的候选蛋白进行生物信息学分析。结果成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备鼠源抗Rab11多克隆抗体。免疫荧光法观察Rab11蛋白定位于贾第虫滋养体细胞膜区域和细胞质中。共筛选出528个与Rab11特异性结合的候选互作蛋白,其中蛋白质评分大于20分的候选互作蛋白有517个,包括124个未知蛋白,393个已知蛋白。GO分析上述蛋白涉及组蛋白修饰、组蛋白单泛素化、代谢过程、建立或维持细胞骨架极性以及内吞等多种生物进程。结论成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备了鼠抗Rab11多克隆抗体。筛选出贾第虫中与Rab11互作的候选蛋白528个,为研究贾第虫Rab11的分子机制奠定了理论基础。

关键词：十二指肠贾第虫 rGdRab11 his-pull down LC-MS/MS 互作蛋白

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家蚕膜蛋白BmP（echA）-like基因与多角体基因融合表达及其相关研究

家蚕膜蛋白BmP（echA）-like基因与多角体基因融合表达及其相关研...

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作者：姜啸风浙江理工大学

学位级别：硕士

膜蛋白因受其自身性质所限,大量表达会对细胞产生毒性作用,且在真核表达系统中低表达。本研究利用多角体（Polh）与目的蛋白融合表达以避免毒性作用并提高表达量。从本实验室所构建的家蚕膜蛋白cDNA库中筛选获得一条基因大小为1127 bp,... 详细信息

膜蛋白因受其自身性质所限,大量表达会对细胞产生毒性作用,且在真核表达系统中低表达。本研究利用多角体（Polh）与目的蛋白融合表达以避免毒性作用并提高表达量。从本实验室所构建的家蚕膜蛋白cDNA库中筛选获得一条基因大小为1127 bp,其中开放阅读框为840 bp的序列,编码一个含279个氨基酸残基的蛋白质,预测分子量为30.3 kDa,等电点为8.79。生物信息学分析发现它与结核分枝杆菌所表达的echA蛋白具有较高的同源性,都含有一个crotonase-like的保守结构域,所以命名这个基因为BmP（echA）-like（Bombyx mori Protein of Enoyl—CoA hydratase like）,GenBank登录号为:DQ311163.1。本研究通过亚克隆技术合成了多角体与BmP（echA）-like的融合基因,分别克隆到原核表达载体和杆状病毒转移载体上构建了pET-32a-Polh-BmP（echA）-like和pFastBac HTb-Polh-BmP（echA）-like,同时构建了未融合多角体的BmP（echA）-lik基因的重组载体pET-32a- BmP（echA）-like和pFastBac HTb-BmP（echA）-like作为表达对照。用终浓度1 mmol/L IPTG诱导pET-32a-Polh-BmP（echA）-like转化的BL21（DE3）工程菌后,裂解产物进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结果与阴性对照以及未融合多角体表达的产物进行对比分析,发现特异的目的融合蛋白条带大小正确。利用pFastBac重组转移载体及家蚕Bac-to-Bac系统构建了重组Bacmid,转染家蚕细胞后表达产物经SDS-PAGE电泳检测表明,在两个不同的表达系统中,融合了多角体的目的蛋白表达量都有明显提高。融合蛋白利用多角体性质调节pH值可方便纯化步骤,通过Ni-NTA柱亲和层析可获得较纯的目的蛋白。纯化的融合蛋白经TEV酶切后,通过调节pH值便能得到单一的BmP（echA）-like蛋白条带。为了解该蛋白在家蚕各组织中的分布,我们做了荧光定量PCR的相关实验,结果显示五龄幼虫的各组织器官均有转录,其中气门转录最高,而表皮组织中最少,转录差异可达近60倍。通过双向电泳分析,发现在家蚕细胞中至少有分别为35 kDa和60 kDa的蛋白与BmP（echA）-like发生相互作用。

关键词：家蚕BmP(echA)-like基因融合表达家蚕杆状病毒表达系统 his-pull down 荧光定量PCR

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舌癌侵袭转移相关因子CD63-LEL互作蛋白筛选及在舌癌细胞中的表达...

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作者：侯美玲锦州医科大学

学位级别：硕士

目的筛选与舌癌细胞总膜蛋白中与侵袭转移相关因子CD63-LEL相互作用的蛋白质整合素β1(Integrinβ1)。采用his-pulldown技术、CO-IP技术、免疫荧光技术进一步验证CD63-LEL与Integrinβ1在体内、体外的相互作用及在舌癌细胞内的共定位。... 详细信息

目的筛选与舌癌细胞总膜蛋白中与侵袭转移相关因子CD63-LEL相互作用的蛋白质整合素β1(Integrinβ1)。采用his-pulldown技术、CO-IP技术、免疫荧光技术进一步验证CD63-LEL与Integrinβ1在体内、体外的相互作用及在舌癌细胞内的共定位。采用体外转染技术、实时定量PCR技术及免疫荧光技术综合分析Integrinβ1在不同舌癌细胞株中的表达变化,初步探索Integrinβ1与CD63-LEL在舌癌细胞内的相互影响。方法1、根据人CD63的m RNA序列(NM01780.5)设计CD63-LEL的特异性引物。提取TCA8113细胞的总RNA,采用RT-PCR扩增CD63-LEL目的基因,采用定向克隆技术插入原核表达载体p ET29a(+)中,构建重组质粒p ET29a(+)-CD63-LEL。2、采用IPTG诱导p ET29a(+)-CD63-LEL在大肠杆菌中的表达,优化表达条件,采用his融合蛋白纯化柱纯化p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白。3、常规操作方法培养舌鳞癌TCA8113细胞,提取TCA8113舌癌细胞总膜蛋白。采用GST-pull down方法以CD63-LEL蛋白为诱饵蛋白,调取TCA8113细胞总蛋白中能够与CD63-LEL相互作用的蛋白质,采用不同抗体进行免疫印迹检测,成功筛选到Integrinβ1与CD63-LEL的相互作用。4、根据人CD63的m RNA序列(NM01780.5)及人整合素β1(gi21856332)序列,设计CD63-LEL与Integrinβ1的融合基因特异性引物,RT-PCR方法扩增目的基因,Infusion方法分别构建重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1。5、采用基因体外共转染技术将重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1瞬时转染TCA8113细胞,采用双向CO-IP方法验证CD63-LEL与Integrinβ1在细胞内的相互作用,荧光共聚焦显微镜技术观察CD63-LEL与Integrinβ1在舌鳞癌细胞中的定位。6、培养TCA8113细胞株、CD63高表达TCA8113细胞株、CD63低表达TCA8113细胞株,采用实时定量PCR及Western Blot方法检测Integrinβ1在各舌鳞癌细胞组中的表达差异,共聚焦显微镜观察各组中Integrinβ1的定位。结果1、成功构建原核表达重组质粒p ET29a(+)-CD63-LEL。结果表明在37℃,IPTG浓度为0.1.0 mmol/L之间时,p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白均可大量表达。IPIG浓度为1.0 mmol/L表达量最高,SDS-PAGE电泳显示,纯化蛋白大小为13.3KD,采用BCA蛋白定量试剂盒检测,纯化蛋白浓度为0.8 mg/ml。2、成功获取TCA8113细胞中总膜蛋白,SDS-PAGE电泳显示总膜蛋白大小位于15-170 KD之间,提取的总膜蛋白浓度为200 ug/ml。3、以纯化的CD63-LEL蛋白为诱饵蛋白,与总膜蛋白杂交后进行his-pull-down检测,采用β1、α1、PI4K等抗体检测互做蛋白,Western Blot实验结果显示,CD63-LEL蛋白与总膜蛋白中Integrinβ1存在相互作用。4、真核表达载体pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1构建成功,将重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1瞬时单转或共转至TCA8113细胞,48h后收集细胞,CO-IP实验结果显示:在15 KD、85 KD处均有条带,与CD63-LEL、Integrinβ1大小一致,结果表明CD63-LEL蛋白与Integrinβ1在细胞内相互作用。5、重组质粒3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1共转染TCA8113细胞,采用免疫荧光技术检测两者在细胞内的共定位,结果显示:CD63-LEL蛋白与Integrinβ1共定位在细胞膜及细胞质。6、培养TCA8113细胞株、CD63高、低表达TCA8113细胞株,48h后收集细胞,采用Real-Time PCR和Western Blot分别检测Integrinβ1在m RNA水平及蛋白水平的表达,Real-Time PCR结果显示CD63高表达细胞株中Integrinβ1的表达是CD63低表达细胞株的两倍,p0.05,差异不具有统计学意义。免疫印迹结果表明:In

关键词：舌鳞癌细胞 CD63-LEL 整合素β1 免疫共沉淀 his-pull down

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