舌癌侵袭转移相关因子CD63-LEL互作蛋白筛选及在舌癌细胞中的表达分析

作     者：侯美玲 

作者单位：锦州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李新;赵微

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：舌鳞癌细胞 CD63-LEL 整合素β1 免疫共沉淀 His-pull down 

摘      要：目的筛选与舌癌细胞总膜蛋白中与侵袭转移相关因子CD63-LEL相互作用的蛋白质整合素β1(Integrinβ1)。采用His-pulldown技术、CO-IP技术、免疫荧光技术进一步验证CD63-LEL与Integrinβ1在体内、体外的相互作用及在舌癌细胞内的共定位。采用体外转染技术、实时定量PCR技术及免疫荧光技术综合分析Integrinβ1在不同舌癌细胞株中的表达变化,初步探索Integrinβ1与CD63-LEL在舌癌细胞内的相互影响。方法1、根据人CD63的m RNA序列(NM01780.5)设计CD63-LEL的特异性引物。提取TCA8113细胞的总RNA,采用RT-PCR扩增CD63-LEL目的基因,采用定向克隆技术插入原核表达载体p ET29a(+)中,构建重组质粒p ET29a(+)-CD63-LEL。2、采用IPTG诱导p ET29a(+)-CD63-LEL在大肠杆菌中的表达,优化表达条件,采用His融合蛋白纯化柱纯化p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白。3、常规操作方法培养舌鳞癌TCA8113细胞,提取TCA8113舌癌细胞总膜蛋白。采用GST-pull down方法以CD63-LEL蛋白为诱饵蛋白,调取TCA8113细胞总蛋白中能够与CD63-LEL相互作用的蛋白质,采用不同抗体进行免疫印迹检测,成功筛选到Integrinβ1与CD63-LEL的相互作用。4、根据人CD63的m RNA序列(NM01780.5)及人整合素β1(gi21856332)序列,设计CD63-LEL与Integrinβ1的融合基因特异性引物,RT-PCR方法扩增目的基因,Infusion方法分别构建重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1。5、采用基因体外共转染技术将重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1瞬时转染TCA8113细胞,采用双向CO-IP方法验证CD63-LEL与Integrinβ1在细胞内的相互作用,荧光共聚焦显微镜技术观察CD63-LEL与Integrinβ1在舌鳞癌细胞中的定位。6、培养TCA8113细胞株、CD63高表达TCA8113细胞株、CD63低表达TCA8113细胞株,采用实时定量PCR及Western Blot方法检测Integrinβ1在各舌鳞癌细胞组中的表达差异,共聚焦显微镜观察各组中Integrinβ1的定位。结果1、成功构建原核表达重组质粒p ET29a(+)-CD63-LEL。结果表明在37℃,IPTG浓度为0.1.0 mmol/L之间时,p ET29a(+)-CD63-LEL蛋白均可大量表达。IPIG浓度为1.0 mmol/L表达量最高,SDS-PAGE电泳显示,纯化蛋白大小为13.3KD,采用BCA蛋白定量试剂盒检测,纯化蛋白浓度为0.8 mg/ml。2、成功获取TCA8113细胞中总膜蛋白,SDS-PAGE电泳显示总膜蛋白大小位于15-170 KD之间,提取的总膜蛋白浓度为200 ug/ml。3、以纯化的CD63-LEL蛋白为诱饵蛋白,与总膜蛋白杂交后进行His-pull-down检测,采用β1、α1、PI4K等抗体检测互做蛋白,Western Blot实验结果显示,CD63-LEL蛋白与总膜蛋白中Integrinβ1存在相互作用。4、真核表达载体pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、p EFHA-Integrinβ1构建成功,将重组质粒pc DNA3.1(+)-3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1瞬时单转或共转至TCA8113细胞,48h后收集细胞,CO-IP实验结果显示:在15 KD、85 KD处均有条带,与CD63-LEL、Integrinβ1大小一致,结果表明CD63-LEL蛋白与Integrinβ1在细胞内相互作用。5、重组质粒3flag-CD63-LEL、HA-Integrinβ1共转染TCA8113细胞,采用免疫荧光技术检测两者在细胞内的共定位,结果显示:CD63-LEL蛋白与Integrinβ1共定位在细胞膜及细胞质。6、培养TCA8113细胞株、CD63高、低表达TCA8113细胞株,48h后收集细胞,采用Real-Time PCR和Western Blot分别检测Integrinβ1在m RNA水平及蛋白水平的表达,Real-Time PCR结果显示CD63高表达细胞株中Integrinβ1的表达是CD63低表达细胞株的两倍,p0.05,差异不具有统计学意义。免疫印迹结果表明:In