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作者：许万青华南理工大学

学位级别：硕士

heparg细胞具有类似人肝祖细胞的双向分化潜能,体外可诱导分化为肝细胞样细胞及胆道样细胞。分化后的肝细胞样细胞表现出与成熟原代人肝细胞相似的特性,大量表达CYP450酶为代表的Ⅰ相代谢酶(如CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4)、Ⅱ相代... 详细信息

heparg细胞具有类似人肝祖细胞的双向分化潜能,体外可诱导分化为肝细胞样细胞及胆道样细胞。分化后的肝细胞样细胞表现出与成熟原代人肝细胞相似的特性,大量表达CYP450酶为代表的Ⅰ相代谢酶(如CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4)、Ⅱ相代谢酶、药物转运体及核受体蛋白等。heparg因此也被FDA、EMA以及OECD等联合推荐为较理想的ADME(Absorption,Distribution,Metabolism,and Excretion)体外研究模型。近年来,随着CRISPR/Cas9技术的发展,通过基因敲除或敲入,可大大提高体外ADME细胞模型对药物评价的灵敏性、特异性及准确性。作为国内外大量指南推荐的ADME体外细胞模型,heparg高效基因编辑的需求日益迫切。然而,基因编辑细胞系的构建主要基于基因编辑与单克隆培养技术结合,长期的单克隆培养及筛选在一定程度上严重影响heparg的分化能力,导致heparg的高效基因编辑仍然具有一定的挑战性。本研究应用CRISPR/Cas9结合同源重组技术对heparg细胞进行高效精准基因插入编辑,从细胞转染方案、sg RNA设计、重组载体设计及筛选等多角度进行系统优化,建立heparg高效精准编辑体系并获得精准基因敲入的细胞亚克隆。在此基础上,进一步针对所获得的基因编辑细胞亚克隆,比较不同heparg细胞分化方案,建立相应的高效细胞分化体系。本研究首先根据基因敲入位点CYP3A4特征,在其终止密码子附近区域设计并构建了3条特异性sg RNA,并在体外HEK293T细胞水平进行sg RNA剪切有效性分析。同时,设计并构建基因敲入的同源重组模板pc DNA3.1-T2A-Luciferase(+HAs)-Donor。将CRISPR/Cas9系统以及同源重组模板共转染heparg细胞,通过G418药筛以及单克隆化培养,得到单克隆细胞。最后通过PCR扩增、测序的方法进行基因敲入鉴定。结果显示,所设计构建的3条sg RNA均能有效靶向并剪切CYP3A4相应位点。经转染后单克隆细胞培养,共筛选获得149个heparg细胞克隆;经PCR及Sanger测序鉴定,其中6个细胞克隆发生T2A-Luciferase基因片段稳定定点敲入。为了进一步研究基因编辑heparg细胞的分化潜能同时优化分化方案,我们对基因敲入heparg-#9和野生型heparg分别应用三种方案进行分化(标准方案、优化方案1及优化方案2),动态追踪比较不同分化方案中细胞表型和关键基因转录及表达的变化。结果表明:T2A-Luciferase基因敲入heparg-#9细胞克隆与野生型heparg具有相似的分化潜能,长时间单克隆培养及基因编辑操作不影响heparg细胞的分化潜能;当采用标准分化方案时,细胞分化至第14天时开始有肝细胞样细胞出现,第28天时肝细胞样细胞的占比约为40%;相比之下,优化方案1分化第5天即出现肝细胞样细胞,在第28天肝细胞样细胞占比高达60%,同时系列肝细胞特异性基因表达水平也显著上调。综上,本论文通过CRISPR/Cas9结合同源重组技术,成功构建T2A-Luciferase基因定点敲入入内源CYP3A4位点的荧光素酶报告细胞系heparg-#9;通过细胞分化方案的优化比较,建立heparg细胞高效诱导分化方案并对基因编辑细胞系进行成功分化,为基因编辑heparg细胞模型的进一步应用奠定前期基础。

关键词： heparg CRISPR/Cas9基因编辑技术基因敲入分化

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Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry

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World Journal of Gastroenterology 2007年第1期13卷 22-38页

作者： Dieter Glebe Stephan Urban Institute of Medical Virology Justus-Liebig University of Giessen Frankfurter Str. 107 D-35392 Giessen Germany Department of Molecular Virology Otto Meyerhof Zentrum University of Heidelberg Im Neuenheimer Feld 350 D-69120 Heidelberg Germany

Hepadnaviridae is a family of hepatotropic DNA viruses that is divided into the genera orthohepadnavirus of mammals and avihepadnavirus of birds. All members of this family can cause acute and chronic hepatic infection, which in the case of human hepatitis B virus （HBV） constitutes a major global health problem. Although our knowledge about the molecular biology of these highly liver-specific viruses has profoundly increased in the last two decades, the mechanisms of attachment and productive entrance into the differentiated host hepatocytes are still enigmatic. The difficulties in studying hepadnaviral entry were primarily caused by the lack of easily accessible in vitro infection systems. Thus, for more than twenty years, differentiated primary hepatocytes from the respective species were the only in vitro models for both orthohepadnaviruses （e.g. HBV） and avihepadnaviruses （e.g. duck hepatitis B virus [DHBV]）. Two important discoveries have been made recently regarding HBV：（1） primary hepatoo/tes from tree-shrews; i.e., Tupaia belangeri, can be substituted for primary human hepatocytes, and （2） a human hepatoma cell line （heparg） was established that gains susceptibility for HBV infection upon induction of differentiation in vitro. A number of potential HBV receptor candidates have been described in the past, but none of them have been confirmed to function as a receptor. For DHBV and probably all other avian hepadnaviruses, carboxypeptidase D （CPD） has been shown to be indispensable for infection, although the exact role of this molecule is still under debate. While still restricted to the use of primary duck hepatocytes （PDH）, investigations performed with DHBV provided important general concepts on the first steps of hepadnaviral infection. However, with emerging data obtained from the new HBV infection systems, the hope that DHBV utilizes the same mechanism as HBV only partially held true. Nevertheless, both HBV and DHBV in vitro infection systems will help

关键词： Hepatitis B virus Duck hepatitis B virus Infection models Receptor Viral attachment Tupaia belangeri heparg Carboxypeptidase D

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体外与体内肝细胞微核检测方法研究

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中国新药杂志 2016年第7期25卷 787-793页

作者：文海若宋捷陈高峰齐乃松李琛耿兴超王雪中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室北京100176

目的：分别利用遗传毒性阳性剂开展体外微核细胞组学和SD大鼠体内肝细胞微核试验,对2种评价方法进行探讨。方法：①体外肝细胞微核细胞组学：在无S9代谢活化条件下使用不同浓度环磷酰胺（CPA,10或40μg·m L^-1）或丝裂霉素C（MMC,0.05,... 详细信息

目的：分别利用遗传毒性阳性剂开展体外微核细胞组学和SD大鼠体内肝细胞微核试验,对2种评价方法进行探讨。方法：①体外肝细胞微核细胞组学：在无S9代谢活化条件下使用不同浓度环磷酰胺（CPA,10或40μg·m L^-1）或丝裂霉素C（MMC,0.05,0.1或0.2μg·m L^-1）与heparg或HepG2细胞作用4或24 h,开展胞质分裂阻滞法微核细胞组学试验。计算每个剂量胞质分裂增殖指数（CBPI）和复制指数（RI）、坏死（Nec）和凋亡（Apop）细胞的千分率以及双核细胞中微核（MN）、核芽（NBUD）和核质桥（NPB）出现的千分率。②体内骨髓微核与肝微核试验：使用6~7周龄SD大鼠,连续3 d分别在0,24和45 h经口灌胃dd H2O,CPA（10,20或40 mg·kg^-1）或EMS（200 mg·kg^-1）。末次给药后取单侧股骨和肝左叶中间约5 mm3大小组织分别制作骨髓和肝细胞微核涂片。镜检计数每组动物的嗜多染红细胞微核率（MNPCE‰）和肝细胞微核率（LMN‰）的平均值与标准差。结果：① heparg细胞经CPA或MMC处理可见MN‰,NBUD‰及NPB‰呈剂量相关性增加,中高剂量组与对照组比较有显著差异（P〈0.05或P〈0.01）;HepG2细胞NBUD‰和NPB‰背景值较高,在高背景值的基础上经CPA或MMC处理均见统计学意义上的显著增加,且增加幅度较大（P〈0.01）;MMC处理组以上2项指标的增幅较CPA处理组更显著。NPB‰不是HepG2细胞的染色体损伤敏感指标。②连续3 d经口灌胃CPA或EMS均可引起SD大鼠MNPCE‰和LMN‰升高。结论：利用heparg开展体外微核细胞组学,可在不添加S9的条件下经阳性剂CPA或MMC处理4 h获得阳性结果,是开展体外肝细胞微核试验的理想研究对象。体内肝细胞微核实验的敏感性和特异性较好,该方法与SD大鼠重复给药毒性实验结合,可对药物肝毒和遗传毒性进行综合预测。

关键词： heparg HepG2 微核细胞组学胞质分裂阻滞微核肝微核

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药物性肝损伤相关DNA甲基化位点功能验证体系的构建

药物性肝损伤相关DNA甲基化位点功能验证体系的构建

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作者：韦雨琦上海交通大学

学位级别：硕士

药物性肝损伤是一种常见的严重药物不良反应,存在明显的个体差异,相同剂量的同种药物在不同患者中引起肝损伤的严重程度和病理改变也不尽相同。迄今为止,全球范围内发现的具有潜在肝毒性的常见上市药物有1100多种,包括抗结核药物、抗肿... 详细信息

药物性肝损伤是一种常见的严重药物不良反应,存在明显的个体差异,相同剂量的同种药物在不同患者中引起肝损伤的严重程度和病理改变也不尽相同。迄今为止,全球范围内发现的具有潜在肝毒性的常见上市药物有1100多种,包括抗结核药物、抗肿瘤药物和中草药等。这些药物在临床疾病治疗中具有重要作用,很难直接通过更换药物而使患者免于肝损伤。研究表明,DNA甲基化修饰的差异是引起药物性肝损伤个体差异的重要原因之一。虽然关联研究发现了CYP2D6和CYP2E1基因启动子区域的高甲基化与抗结核药物引起的肝损伤相关,然而目前尚无能够对药物性肝损伤相关DNA甲基化位点进行验证和功能研究的实验体系。因此,一个可验证药物性肝损伤相关DNA甲基化位点的细胞体系亟需被建立。本研究建立了一种新的检测DNA甲基化功能的肝细胞模型,并确立了与药物性肝损伤相关的四个检测指标,包括细胞存活率、细胞外乳糖脱氢酶含量、细胞内谷胱甘肽含量以及细胞内Caspase3/7活性,从而构建了一个药物性肝损伤相关DNA甲基化位点功能验证体系。应用该体系,我们发现CYP2D6和CYP2E1基因启动子区域的高甲基化参与了抗结核药物利福平导致的肝损伤的发生。在利福平处理过的heparg细胞中,CYP2D6和CYP2E1的甲基化水平与细胞存活率以及细胞内谷胱甘肽含量正相关,与细胞内Caspase3/7活性负相关。本研究首次在体外细胞模型中验证了CYP2D6和CYP2E1启动子区域的高甲基化与药物性肝损伤之间的相关性。该DNA甲基化位点功能验证体系不仅能够在体外系统中验证DNA甲基化与药物性肝损伤之间的相关性,同时也为其它针对DNA甲基化功能和药物性肝损伤反应发生机制的研究提供了新的建模思路和前期基础,进而为推动个体化用药的研究进程奠定基础。

关键词：药物性肝损伤 DNA甲基化 heparg CYP2E1 CYP2D6

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不同肝细胞系微核细胞组学研究

不同肝细胞系微核细胞组学研究

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中国毒理学会第七次全国毒理学大会暨第八届湖北科技论坛

作者：文海若齐乃松耿兴超王雪中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室

【目的】肝细胞系较为完整地保留了代谢酶及活性,可在不添加S9的条件下对需S9活化才能产生毒性的化合物开展遗传毒性研究。本研究分别利用不同来源的人肝细胞系（heparg、HepG2和L02）对比不同试验条件下遗传毒性阳性剂对细胞毒性和微... 详细信息

【目的】肝细胞系较为完整地保留了代谢酶及活性,可在不添加S9的条件下对需S9活化才能产生毒性的化合物开展遗传毒性研究。本研究分别利用不同来源的人肝细胞系（heparg、HepG2和L02）对比不同试验条件下遗传毒性阳性剂对细胞毒性和微核相关指标出现率的影响。【材料和方法】在无S9代谢活化条件下使用不同浓度环磷酰胺（CPA,10、40μg/mL）)或丝裂霉素C（MMC,0.05、0.1、0.2μg/mL）与heparg或HepG2细胞作用4 h或24 h（L02细胞处理仅设无S9条件,作用4h）,开展胞质分裂阻滞法微核细胞组学试验。计算每个剂量胞质分裂增殖指数（CBPI）和复制指数（RI）、坏死（Nec）和凋亡（Apop）细胞的千分率、以及双核细胞中微核（心）、核芽（NBUD）和核质桥（NPB）出现的千分率。【结果】1)细胞毒性:所有肝细胞经4h不同浓度CPA或MMC处理后未见显著细胞增殖抑制毒性,而经MMC处理的Apop‰存在与给药相关的增加（P＜0.05）。经高剂量MMC处理24h后,heparg和HepG2细胞均出现细胞增殖抑制毒性,CPA对细胞增殖作用不明显。24 h持续处理后heparg和HepG2均见给药甚至剂量相关的Apop%增加（p＜0.05）。不同时间处理的给药组细胞Nec‰未见统计学意义的显著增加。2)遗传毒性:正常人肝细胞来源的L02细胞经MMC处理4 h可见MN‰（对照组及不同浓度处理组分别为2‰、15%‰、23%‰及35%‰,p＜0.05）和NBUD%（对照组及不同浓度处理组分别为8‰、39‰、52‰及67‰,p＜0.05）呈剂量相关性增加;但NPB‰出现率在低剂量即达到高峰22‰),随剂量升高显降低趋势。源于人肝祖细胞的heparg经CPA或MMC处理可见MN‰、NBUD‰及NPB‰呈剂量相关性增加,中、高剂量组与对照组比较有显著差异（4h处理组CPA 40μg/mL分别为61‰、66‰和19‰;MMC 0.2μg/mL分别为82‰、56‰和20‰,p＜0.05）。肿瘤来源的HepG2细胞NBUD‰和NPB‰背景值较高（24h处理分别为12‰、9‰）,在高背景值的基础上经CPA或MMC处理均见统计学意义上的显著增加24h处理组CPA 40μg/mL分别为41‰和14‰、MMC 0.2μg/mL为13%‰和26‰,p＜0.05。【结论】对于以上三种肝细胞来说,MN‰是最敏感,且浓度依赖关系最显著的生物标志物。NPB‰对于HepG2细胞而言并不灵敏,提示肝细胞DNA错误修复和或端粒末端融合在染色体损伤的较早阶段出现。HepRG细胞代谢能力强,且DNA状态较为稳定,CPA或MMC给药处理4h均可获得阳性结果,是开展体外肝细胞微核试验的理想研究对象。

关键词： heparg HepG2 微核细胞组学肝微核

来源： cnki会议评论

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