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AngⅡ-ROS诱导HSC-LX2焦亡调节途径的确定及合欢皮-白蒺藜药对的干预作用

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AngⅡ-ROS诱导HSC-LX2焦亡调节途径的确定及合欢皮-白蒺藜药对的...

作者：谢泽宇浙江中医药大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在确定AngⅡ-ROS诱导的人肝星状细胞系(HSC-LX2)活化过程中细胞焦亡的调控途径,并探讨合欢皮-白蒺藜药对对其干预作用,为抗肝纤维化治疗提供新的见解。方法:1.建立AngⅡ诱导的HSC-LX2细胞活化模型。所有实验均在HSC-LX2中... 详细信息

目的:本研究旨在确定AngⅡ-ROS诱导的人肝星状细胞系(HSC-LX2)活化过程中细胞焦亡的调控途径,并探讨合欢皮-白蒺藜药对对其干预作用,为抗肝纤维化治疗提供新的见解。方法:1.建立AngⅡ诱导的HSC-LX2细胞活化模型。所有实验均在HSC-LX2中进行,CCK8用于检测细胞增殖和活性。细胞形态学变化在光学倒置显微镜下观察。采用氧化敏感探针(DCFH-DA)检测ROS生成。乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒用于检测受损细胞释放的LDH,酶联免疫吸附测定法(ELISA)用于定量白介素-18(IL-18)和白介素1β(IL-1β)水平。Western blotting和RT-PCR检测:细胞内肌动蛋白α(α-SMA)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-4(Caspase-4)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-5(Caspase-5)、含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及消皮素D的N端片段(GSDMD-N)的蛋白表达和mRNA水平。2.建立AngⅡ诱导的HSC-LX2细胞活化模型。不同浓度的NAC和NSA干预后,通过CCK8检测细胞活性。DCFH-DA检测ROS生成。LDH检测试剂盒用于检测受损细胞释放的 LDH,ELISA 用于定量 IL-18 和 IL-1β 水平。Western blotting 和 Real-time PCR 检测 AngⅡ诱导的 HSC-LX2 细胞中 α-SMA、ASC、NLRP3、Caspase-1、-4、-5 和GSDMD-N的蛋白表达和mRNA水平。3.在网络药理学研究中,通过在线数据库TCMSP、TCMID、DrugBank、PubChem、SwissADME、SwissTargetPrediction、GeneCards、OMIM 和中国知网获取药物成分以及药物和疾病相关靶点,构建相关网络,并进行GO和KEGG分析,最后通过分子对接技术初步验证。4.建立AngⅡ诱导HSC-LX2细胞活化模型。不同浓度的药对含药血清干预后,通过CCK8检测细胞增殖和活性。DCFH-DA检测ROS生成。ELISA用于定量IL-18和IL-1β水平。Western blotting和Real-time PCR检测AngⅡ诱导的细胞内焦亡经典通路的蛋白和mRNA水平。结果:1.与空白组相较,经AngⅡ刺激后,HSC-LX2细胞活力增强(P2.HSC-LX2经AngⅡ诱导后,再给予NAC和NSA处理,与AngⅡ相比,NAC和NSA处理后,HSC-LX2细胞活力(PHSC-LX2,显著抑制ROS、IL-18、IL-1β等炎症因子的表达(PHSC-LX2细胞内NLRP3、Caspase-1、α-SMA、GSDMD-N等的表达明显增加,而在药对作用下,其表达则明显降低(PHSC-LX2细胞发生焦亡。与LPS所诱导的焦亡不同,AngⅡ诱导Caspase-4、-5活化与其上调ROS的含量相关。合欢皮-白蒺藜药对对焦亡的干预作用与其抑制焦亡经典通路相关,且与网络药理学预测一致。其作用机理尚需进一步研究和验证。

关键词：细胞焦亡合欢皮-白蒺藜药对 HSC-LX2 网络药理学机制

Artemlavanins A and B from Artemisia lavandulaefolia and Their Cytotoxicity Against Hepatic Stellate Cell Line lx2

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Natural Products and Bioprospecting 2020年第4期10卷 243-250页

作者： Cheng Shen Xiao-Yan Huang Chang-An Geng Tian-Ze Li Shuang Tang Li-Hua Su Zhen Gao Xue-Mei Zhang Jing Hu Ji-Jun Chen State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China Kunming Institute of BotanyChinese Academy of SciencesKunming 650201People’s Republic of China Yunnan Key Laboratory of Natural Medicinal Chemistry Kunming 650201People’s Republic of China University of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049People’s Republic of China

Two new sesquiterpenoids,artemlavanins A(1)and B(3),together with fifteen known compounds(2 and 4−17)were iso-lated from the EtOH extract of Artemisia lavandulaefolia.The structures of new compounds were elucidated by extensive spectroscopic analyses(HRESIMS,1D and 2D NMR)and ECD calculations.Compound 1 was a sesquiterpenoid lactone possessing a rearranged eudesmane skeleton;compounds 2-5,6-8,9 and 10-12 belonged to the eudesmane,guaiane,oppositane and farnesane sesquiterpenoids,respectively;compounds 13-17 were the phenyl derivatives with a 4-hydroxy-acetophenone moiety.Twelve compounds(1-3,5-7,10-12,14,15 and 17)displayed cytotoxicity against hepatic stellate cell line lx2(HSC-LX2)with IC50 values ranging from 35.1 to 370.3μM.Compounds 2,7,10-12 and 17 exhibited the stronger cytotoxicity than silybin(IC50,169.6μM)with IC50 values of 82.1,35.1,95.0,83.8,81.6 and 90.1μM.Compound 7 as the most active one showed significant inhibition on the deposition of human collagen type I(Col I),human hyaluronic acid(HA)and human laminin(HL)with IC50 values of 10.7,24.5 and 13.3μM.

关键词： Artemisia lavandulaefolia Sesquiterpenoids Artemlavanins Cytotoxicity HSC-LX2

鳖甲煎丸对AngⅡ-ROS诱导下HSC-LX2细胞中PKC-Pyk2/SRC通路的影响

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浙江中医药大学学报 2019年第4期43卷 297-304页

作者：曹晓倩董文珠王璐陈杭萍姚立浙江中医药大学杭州310053

[目的]探讨鳖甲煎丸含药血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)作用下HSC-LX2细胞中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)-富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase 2,Pyk2)/SRC通路的影响。[方法]以人源肝星状细胞HSC-LX2为研究对象,以AngⅡ诱导产生ROS,再以鳖甲煎丸含药血清进行干预,以MTT法检测HSC-LX2细胞的增殖情况,荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS含量,Western blot检测PKC、Pyk2、SRC蛋白表达情况。[结果] MTT结果显示,与AngⅡ组比较,5%鳖甲煎丸含药血清培养24h后,鳖甲煎丸高、中剂量组显著抑制HSC-LX2细胞增殖(PHSC-LX2细胞增殖(P2h后,中剂量组有显著抑制效果(P0.05)。荧光探针DCFH-DA结果显示,与空白对照组比较,AngⅡ组ROS产生明显增多,经鳖甲煎丸含药血清高、中剂量组干预后,ROS均不同程度减少。Western blot显示,鳖甲煎丸含药血清干预后,PKC(P2(PHSC-LX2细胞经AngⅡ刺激后可以产生ROS,且细胞增殖明显,此过程与PKC、Pyk2、SRC蛋白的激活有关。鳖甲煎丸可通过减少ROS的产生来阻止HSC-LX2细胞的增殖,其机制与抑制PKC、Pyk2、SRC蛋白的表达有关。

关键词：肝纤维化 HSC-LX2 AngⅡ ROS PKC Pyk2 SRC 鳖甲煎丸

AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时对ROS-（ACE-AngⅡ-AT1R/ACE2-Ang（1-7）-Mas）通路的影响及鳖甲煎口服液的干预作用

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AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时对ROS-（ACE-AngⅡ-AT1R/ACE2-Ang（1...

作者：张云龙浙江中医药大学

学位级别：硕士

研究背景和目的：肝纤维化(liver-fibrosis)是慢性肝病向肝硬化转变的重要病理过程,其发生主要是与细胞外基质(ECM)成分的过度合成与异常沉积有关,其重点在于肝星状细胞(hsc)活化与增殖。近来研究表明,诸多肝损伤因素在其致病过程中均... 详细信息

研究背景和目的：肝纤维化(liver-fibrosis)是慢性肝病向肝硬化转变的重要病理过程,其发生主要是与细胞外基质(ECM)成分的过度合成与异常沉积有关,其重点在于肝星状细胞(hsc)活化与增殖。近来研究表明,诸多肝损伤因素在其致病过程中均不同程度地伴有氧化应激(oxidative stress,OS)。ROS包括氧自由基及其歧化物,如羟自由基(.OH)、单线态氧自由基(02)及超氧阴离子自由基(02-)等等。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为肾素-血管紧张素系统(RAS)中最主要的生物活性物质,在hsc活化、收缩、增殖过程中均起重要作用。电子自旋共振(ESR)是目前研究自由基最有效最准确的方法,采用自旋补集技术则可很好的完成自由基的测定,进而明确自由基进攻细胞膜引起细胞膜磷脂过氧化和膜蛋白构象改变的机制及药物抗氧化的保护机制。已有文献报道鳖甲煎口服液有抗肝纤维化作用。本实验通过ESR技术探索AngⅡ诱导人肝星状细胞(HSC-LX2)产生自由基的类型、通过给药时间的差异来观察鳖甲煎口服液对AngⅡ诱导人肝星状细胞(HSC-LX2)产生自由基的影响及其对ROS-(ACE-Ang Ⅱ-AT1R/ACE2-Ang(1-7)-Mas)相关通路的影响,为肝纤维化的临床早期干预提供新的思路。方法：利用Ang Ⅱ模拟氧化应激条件以诱导HSC-LX2细胞株增殖,用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测增殖情况,ESR捕获培养液中自由基以观察HSC-LX2增殖不同阶段自由基的特点,用蛋白芯片技术检测与hsc增殖及氧化应激相关的信号通路;采用免疫组化法检测ACE2、Mas及用RT-PCR法检测Mas、ACE2的表达。结果： Ang Ⅱ诱导HSC-LX2氧化应激时对细胞活力的影响：复苏后细胞生长良好;与正常组对比AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时细胞活力水平提高(PHSC-LX2氧化应激时产生的自由基类型：采用电子自旋共振仪及自旋捕集技术,利用多种自由基捕获剂捕捉HSC-LX2氧化应激时产生的自由基,与正常组比较,共产生两种类型自由基即单线态氧自由基和羟自由基。不同给药时间给药对细胞HSC-LX2氧化应激状态即自由基产生情况的影响：细胞氧化应激前给药与氧化应激后给药,对HSC-LX2因AngⅡ诱导氧化应激而产生的自由基均有一定抑制作用,但细胞发生氧化应激后给药,抑制作用更强。鳖甲煎口服液对Ang Ⅱ诱导HSC-LX2氧化应激时Ang Ⅱ、Ang(1-7)、ACE、ACE2、AT1R、Mas、蛋白表达位置及ACE2和Mas的mRNA表达的影响：与模型组对比,经鳖甲煎口服液干预后Ang(1-7)、ACE2、Mas蛋白表达位置明确且ACE2和Mas的mRNA表达差异明显。鳖甲煎口服液对血管紧张素2诱导HSC-LX2氧化应激时各通路的影响：利用蛋白芯片技术共作出可磷酸化结合点583个,其中,针对氧化应激并产生肝纤维化的磷酸化蛋白主要分布在MAPK通路,TGFβ-Smad通路,及NF-κB通路上,其中以MAPK通路上磷酸化靶点分布最多,为主要通路,BOL通过抑制JAK-STAT通路、TGFβ-Smad通路、MAPK通路及NF-κB通路的活化,激活Ang(1-7)水平进而抑制Ang Ⅱ产生ROS的水平以实现对抗肝纤维化的发生与发展。结合肝纤维化的发生机制,显示出ROS即自由基的产生与消除对肝纤维化的发生与治疗或预防过程中的突出重要地位,为临床肝纤维化的早期发现提供新的思路。结论：1、AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时可产生两种自由基即羟自由基和单线态氧自由基;2、不同时间应用中药鳖甲煎口服液复方均可有效抑制AngⅡ诱导HSC-LX2氧化应激时产生的羟自由基,但对单线态氧自由基效果较弱;3中药鳖甲煎口服液复方在抑制细胞氧自由基的产生,拮抗ACE-Ang Ⅱ-AT1R轴的作用;同时,增强Ang(1-7)、ACE2及Mas受体的作用,即BOL通过抑制 JAK-STAT通路TGFβ-Smad通路、MAPK通路NF-κB通路的活化,激活Ang(1-7)水平进而抑制AngⅡ产生ROS的水平以实现对抗肝纤维化的发生与发展。结合肝纤维化的发生机制,显示出ROS即自由基的产生与消除对肝纤维化的发生与治疗或预防过程中的突出重要地位,为临床肝纤维化的早期发现提供新的思路。

关键词：肝纤维化氧化应激 ESR HSC-LX2 鳖甲煎口服液蛋白芯片技术

滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用

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滇产铁皮石斛对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用

作者：于亚男大理大学

学位级别：硕士

目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛(Dendrobium candidum from Yunnan,DCY)对CCl诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖(Dendrobium candidum polysaccharide,DCP)对活化肝星状... 详细信息

目的:观察不同剂型的滇产铁皮石斛(Dendrobium candidum from Yunnan,DCY)对CCl诱导肝纤维化大鼠肝组织病理学、肝功能和肝纤维化生化学指标的影响,同时通过体外观察铁皮石斛多糖(Dendrobium candidum polysaccharide,DCP)对活化肝星状细胞系lx2(Hepatic stellate cell lx2,HSC-LX2)增殖、凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:(1)实验一:选取86只SD大鼠,将其随机分为正常组15只、模型组71只,模型组大鼠行CCl皮下注射诱导肝纤维化,正常组给予等量生理盐水处理,每周3次,同时称体重。连续注射5周后,随机处死正常组和模型组大鼠各5只,行肝组织病理切片,镜下观察各组肝组织的病理学改变。再随机选取8只正常组大鼠为阴性对照组(NG),剩余MG 64只大鼠随机分为DCY粉剂组(DDG)、鲜榨组(FDG)、秋水仙碱阳性对照组(CG)和模型组(MG),其中粉剂组和鲜榨组又随机分别分为低浓度组(DGl,0.15g/m L)、中浓度组(DGm,0.45g/m L)、高浓度组(DGh,0.75g/m L)。DCY的粉剂和鲜榨组分别给药浓度由低到高分别为0.15g/m L、0.45g/m L、0.75g/m L,CG给予秋水仙碱浓度为0.002%,同时MG和NG给予等量生理盐水,各组给药剂量均为3 m L/只,每天灌胃1次。连续灌胃4周后,各组大鼠称体重,断头处死,立即在无菌条件下剖腹行腹主动脉采血,然后观察肝的色泽、质地,并取肝称肝重,计算肝脏指数(Liver index,LI);采用HE染色、Masson染色法,镜下观察各组肝组织的病理学改变;通过免疫组织化学染色法,检测各组肝组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达情况;应用血液生化仪检测大鼠血清肝功能指标ALP、AST、GPT的改变,并采用ELISA法检测其血清肝纤维化指标HA、LN、PCIII的变化。(2)实验二:体外传代HSC-LX2,取对数生长期细胞培养,以5×10/孔的细胞密度种入6孔板,分阴性对照组和DCP组进行划痕实验,其中DCP组给予含药浓度为400ug/m L,然后检测HSC-LX2在2 h、6 h、12 h、24 h、48 h的细胞迁移率;另体外培养HSC-LX2,以1×10/孔的细胞密度种入96孔板,分为阴性对照组(NG)、25ug/m L DCP组(DCPG-25)、50ug/m L DCP组(DCPG-50)、100ug/m L DCP组(DCPG-100)、200ug/m L DCP组(DCPG-200)、400ug/m L DCP组(DCPG-400),分别给予不同浓度的DCP处理24 h后,采用MTT法检测并计算DCP对HSC-LX2的抑制率;同上方法体外培养HSC-LX2,以5×10/孔的细胞密度接种至6孔板内,分为阴性对照组(NG)、100ug/m L DCP组(DCPG-100)、200ug/m L DCP组(DCPG-200)、400ug/m L DCP组(DCPG-400),细胞培养12h时后,低、中、高浓度组分别加入DCP的浓度为100μg/m L、200μg/m L、400μg/m L,各孔加入同等液量1.5 m L,作用24h后,倒置显微镜下观察细胞形态并进行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:(1)实验一:(1)一般情况及肝脏外观的变化:模型制备期间MG大鼠一般状态差,体重呈缓慢上升态势,两种剂型的DCY给药干预后,DDG、FDG、CG三组大鼠一般状态好转。NG大鼠肝脏多分为6叶,呈棕红色,表面滑润,质地柔软;MG大鼠肝脏则偏暗红色,肝表面可见弥漫性小结节,质地偏韧;DDG、FDG、CG三组大鼠肝脏质地较韧并有颗粒感,但与MG比较均有较明显改善。(2)LI变化:与NG比较,MG大鼠LI明显升高(P0.05);与MG比较,DDGl、DDGm、DDGh、FDGl、FDGm、FDGh、CG的LI均明显降低(P0.05);与DDGh比较,DDGl的LI降低不明显,有统计学意义(P0.05)。(3)肝组织病理学改变:HE染色显示,NG大鼠肝脏细胞形态正常,核圆居中,肝细胞索呈放射状排列紧密;MG大鼠肝脏细胞排列紊乱,细胞内广泛形成脂肪空泡,可见大量假小叶形成,汇管区扩大,有炎细胞浸润;CG、DDG、FDG大鼠的肝损伤均有明显改善。Masson染色显示,NG大鼠肝组织中的肝细胞形态正常,肝细胞索排列规则,细胞内未见明显脂肪空泡,汇管区无明显

关键词：肝纤维化肝星状细胞 HSC-LX2 铁皮石斛中医药

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珊塔玛内酯衍生物合成及抗肝纤维化活性研究

珊塔玛内酯衍生物合成及抗肝纤维化活性研究

作者：王金平陕西师范大学

学位级别：硕士

肝纤维化是由肝损伤引发的可逆性病理状态,几乎所有的慢性肝脏疾病都伴有肝纤维化的发生,如不能有效的抑制,则会加速肝硬化或肝癌的发生。全球每年约有200万人死于各种肝病,占世界死亡率的3.5%,严重威胁着人类的生命安全,并造成了不可... 详细信息

肝纤维化是由肝损伤引发的可逆性病理状态,几乎所有的慢性肝脏疾病都伴有肝纤维化的发生,如不能有效的抑制,则会加速肝硬化或肝癌的发生。全球每年约有200万人死于各种肝病,占世界死亡率的3.5%,严重威胁着人类的生命安全,并造成了不可估量的经济损失。虽然近年来抗肝纤维化药物的研究取得了一定的进展,以抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells,hscs）活化与增殖、炎症反应、氧化应激反应和细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的沉积等为治疗切入点研发的多种候选药物已在临床试验阶段,但目前仍无药物通过临床上市,一些候选药物也因未能达到预期治疗效果而终止临床研究。天然产物是药物研发的重要来源,本研究组前期以抗肝纤维化活性为导向,从野艾蒿（Artemisialavandulaefolia）中分离得到倍半萜化合物珊塔玛内酯（santamarin,STM）对肝星状细胞 lx2（hepatic stellate cell line lx2,HSC-LX2）具有抑制活性,对细胞外基质中Ⅰ型胶原蛋白（human collagen type Ⅰ,Col Ⅰ）和人层粘连蛋白（human laminin,HL）也具有抑制活性,表明其是潜在的抗肝纤维化先导分子。为寻找结构新颖、活性显著的抗肝纤维化候选药物分子,对珊塔玛内酯进行结构修饰,通过氮杂迈克尔加成、氧化、酯化等反应得到26个衍生物,以HSC-LX2细胞为筛选模型、水飞蓟宾为阳性对照,对合成的衍生物进行活性筛选。结果表明8个衍生物对HSC-LX2细胞的抑制活性强于STM（IC50,16.5 μM）,其中衍生物2-17、2-20和2-25的活性分别比STM增加了 3、4和5倍,IC50分别为6.4 μM、4.6μM和3.5 μM。其构效关系可总结为:（1）α,β-不饱和内酯是维持对HSC-LX2抑制活性的药效团;（2）C3-C4双键的还原导致活性降低;（3）羟基氧化为酮不利于其活性的保持;（4）酯侧链的取代基团可显著影响活性,长链的烷基、极性基团以及吡非尼酮片段不利于活性的保持,五氟和间位的三氟甲基取代的肉桂酰基有利于提高活性;（5）二酯化衍生物的活性显著提高。对发现的三个活性最好的衍生物进行了进一步的细胞外基质研究,结果表明衍生物2-20对HSC-LX2细胞中Col I、HL和人体透明质酸（human hyaluronic acid,HA）的抑制活性优于STM,IC50分别为 6.1、3.3 和 7.9μM。本研究初步揭示了 STM衍生物对HSC-LX2细胞和三种细胞外基质的抑制活性及其构效关系,特别是衍生物2-20对HSC-LX2细胞及其三种细胞外基质的抑制活性均优于STM,有望开发为新型抗肝纤维化候选药物分子。

关键词：珊塔玛内酯衍生物抗肝纤维化 HSC-LX2 细胞外基质