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补肾活血汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路对hei-oc1细胞的抗衰老作用

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中成药 2023年第3期45卷 930-935页

作者：郭向东王青玲张梦娴周颖东康浩然王庆林河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科河南郑州450000 河南中医药大学河南郑州450046 河南医学高等专科学校河南郑州451191

目的探讨补肾活血汤延缓耳蜗毛细胞株hei-oc1衰老的潜在机制。方法应用D-半乳糖建立衰老hei-oc1细胞模型,设立对照组、模型组、补肾活血汤组、PI3K抑制剂组和补肾活血汤+PI3K抑制剂组。采用ELISA法检测细胞SOD、GSH-Px活性和MDA水平,DCF... 详细信息

目的探讨补肾活血汤延缓耳蜗毛细胞株hei-oc1衰老的潜在机制。方法应用D-半乳糖建立衰老hei-oc1细胞模型,设立对照组、模型组、补肾活血汤组、PI3K抑制剂组和补肾活血汤+PI3K抑制剂组。采用ELISA法检测细胞SOD、GSH-Px活性和MDA水平,DCFH-DA法检测细胞ROS水平,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞Beclin-1、P62、Bcl-2、Bax mRNA表达。结果与对照组比较,模型组hei-oc1细胞SOD和GSH-Px活性、ROS水平、Beclin-1和Bcl-2 mRNA表达均降低(P细胞凋亡率、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达、P62和Bax mRNA表达均升高(Phei-oc1细胞的衰老,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

关键词：补肾活血汤 hei-oc1细胞衰老氧化应激凋亡自噬 PI3K/Akt/mTOR信号通路

银杏内酯B调控E2f1/Cdk1抑制妥布霉素诱导的hei-oc1细胞凋亡

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中华耳科学杂志 2023年第6期21卷 861-865页

作者：王大华何茜赵凯王浩刘芳芳中国矿业大学徐州221008 中国矿业大学附属医院徐州221008 鄂东医疗集团黄石市中心医院黄石435000

目的探究银杏内酯B对妥布霉素诱导的House Ear Institute-Organ of Corti 1(hei-oc1)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法研究选用hei-oc1小鼠耳蜗毛细胞,使用妥布霉素或妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞,通过EdU实验检测对细胞增殖的影响,... 详细信息

目的探究银杏内酯B对妥布霉素诱导的House Ear Institute-Organ of Corti 1(hei-oc1)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法研究选用hei-oc1小鼠耳蜗毛细胞,使用妥布霉素或妥布霉素联合银杏内酯B处理细胞,通过EdU实验检测对细胞增殖的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达及对E2f1/Cdk1通路的调节作用。结果妥布霉素处理细胞后,hei-oc1细胞增殖能力降低(P细胞Bcl2表达降低,而Bax、Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9表达升高(P细胞后,E2f1和Cdk1蛋白的表达水平显著降低;银杏内酯B可降低妥布霉素对hei-oc1细胞增殖、凋亡的影响(Phei-oc1内耳细胞凋亡。

关键词：银杏内酯B hei-oc1细胞妥布霉素细胞凋亡

miR-96通过SIRT1调控小鼠耳蜗老化hei-oc1细胞凋亡的研究

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miR-96通过SIRT1调控小鼠耳蜗老化HEI-OC1细胞凋亡的研究

作者：袁佳添宁波大学

学位级别：硕士

目的:本研究通过构建毛细胞株hei-oc1(House Ear Institute-Organ of Corti 1)老化模型,探索miR-96是否通过SIRT1调控其凋亡,并在RNA及分子水平探讨miR-96调控hei-oc1凋亡的机制,为老年性耳聋的防治提供理论依据。方法:用不同浓度D-半... 详细信息

目的:本研究通过构建毛细胞株hei-oc1(House Ear Institute-Organ of Corti 1)老化模型,探索miR-96是否通过SIRT1调控其凋亡,并在RNA及分子水平探讨miR-96调控hei-oc1凋亡的机制,为老年性耳聋的防治提供理论依据。方法:用不同浓度D-半乳糖的培养基培养hei-oc1细胞72h,通过CCK8检测细胞活性,筛选合适的D-半乳糖浓度构建hei-oc1细胞老化模型。通过流式细胞仪检测hei-oc1细胞的凋亡情况及Western blot法检测细胞老化标志物P53、P38及凋亡标志物caspase3蛋白的表达,验证hei-oc1细胞老化模型建模构建成功与否。qRT-PCR检测15mg/ml D-半乳糖组hei-oc1细胞中miR-96与SIRT1mRNA的表达,Western blot法检测老化hei-oc1细胞中SIRT1的表达情况,并与对照组进行比较。化学合成miR-96模拟物或抑制物转染hei-oc1细胞,qRTPCR检测转染后老化hei-oc1细胞中miR-96、SIRT1 mRNA的表达,Western blot法检测SIRT1及caspase3蛋白的表达。结果:hei-oc1细胞活性随着D-半乳糖浓度的增加而降低。hei-oc1细胞在15mg/ml D-半乳糖条件下培养72h后,细胞凋亡率为6.06±0.59%,与对照组(凋亡率3.86±0.64%)相比,差异具有统计学意义(phei-oc1细胞P53、P38表达明显增加(p细胞老化成功。caspase3表达明显增加(Phei-oc1细胞老化,其凋亡亦有增加。15mg/ml D-半乳糖组hei-oc1细胞中miR-96与SIRT1 mRNA和蛋白的表达均明显减低(phei-oc1细胞中miR-96、SIRT1 mRNA与蛋白的表达均有下降,miR-96、SIRT1同时参与hei-oc1细胞的老化。miR-96可通过上调SIRT1抑制hei-oc1细胞的凋亡。miR-96、SIRT1可能成为保护老年性耳聋耳蜗毛细胞的作用靶点,为老年性耳聋的防治提供新思路。

关键词：老年性耳聋 miR-96 SIRT1 hei-oc1细胞凋亡

基于代谢组学的水杨酸钠对hei-oc1细胞损伤作用机制

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中国药科大学学报 2021年第5期52卷 566-572页

作者：何明哲彭英王广基阿基业郑亦文孙建国中国药科大学药物代谢动力学重点实验室南京210009 新西兰奥塔哥大学生物医学学院药理毒理学系达尼丁9054

基于LC-Q-TOF/MS技术探究水杨酸钠对小鼠hei-oc1毛细胞样细胞中内源性代谢的影响。首先采用不同浓度的水杨酸钠处理hei-oc1细胞,使用CCK-8法检测细胞存活率的变化。然后观察不同干预时间下水杨酸钠对细胞形态的影响,并利用代谢组学技术... 详细信息

基于LC-Q-TOF/MS技术探究水杨酸钠对小鼠hei-oc1毛细胞样细胞中内源性代谢的影响。首先采用不同浓度的水杨酸钠处理hei-oc1细胞,使用CCK-8法检测细胞存活率的变化。然后观察不同干预时间下水杨酸钠对细胞形态的影响,并利用代谢组学技术进行研究,筛选组间差异代谢产物,分析相关的代谢通路。结果表明,水杨酸钠能够显著抑制heioc1细胞的存活率,且随着浓度的增加,抑制作用增强。同时水杨酸钠能够使细胞形态拉长,并在停止给药后恢复正常。水杨酸钠处理hei-oc1细胞后共筛选出乳清酸、尿苷、天冬氨酸等18种差异代谢物,主要涉及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢及嘧啶代谢这两条可能的代谢通路。综上所述,本研究通过代谢组学技术评价了水杨酸钠对hei-oc1细胞的作用,可为水杨酸钠耳毒性及耳鸣的发生发展研究提供新思路。

关键词：水杨酸钠代谢组学 hei-oc1细胞生物标志物

基于自噬与凋亡平衡探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株hei-oc1的保护作用

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中国老年学杂志 2022年第2期42卷 371-376页

作者：郭向东王青玲张梦娴王庆林河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科河南郑州450000 河南中医药大学河南医学高等专科学校

目的探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株hei-oc1自噬和凋亡的影响。方法应用D-半乳糖构建衰老hei-oc1细胞的体外模型后,将细胞分为对照组、衰老组、含药血清低、中及高剂量组(5%、10%、20%),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测耳蜗hei-oc1细胞的... 详细信息

目的探讨补肾活血汤对衰老耳蜗毛细胞株hei-oc1自噬和凋亡的影响。方法应用D-半乳糖构建衰老hei-oc1细胞的体外模型后,将细胞分为对照组、衰老组、含药血清低、中及高剂量组(5%、10%、20%),采用噻唑蓝(MTT)比色法检测耳蜗hei-oc1细胞的增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老状态;膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡的程度;Western印迹检测细胞中自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。结果MTT、β-半乳糖苷酶染色、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Western印迹结果显示,与对照组比较,衰老组hei-oc1细胞增殖能力明显下降;细胞衰老状态明显增加,细胞凋亡率明显增加,Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平明显下降,p62和Bax蛋白表达水平显著升高(均Phei-oc1细胞增殖能力明显上升;细胞凋亡率明显降低;Atg5、Atg12、Beclin1和Bcl-2蛋白表达水平显著增加(均P细胞株hei-oc1的衰老,且与其浓度相关。

关键词：补肾活血汤衰老自噬凋亡 hei-oc1细胞

氧化应激损伤与hei-oc1细胞株中Prestin表达的相关性分析

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听力学及言语疾病杂志 2017年第1期25卷 49-52页

作者：王军义赖晓敏龚丽娟夏源王致广东药科大学公共卫生学院广州510310 广州市第十二人民医院

目的观察氧化应激损伤对hei-oc1细胞Prestin表达的影响,探讨感音性聋的发生机制。方法采用不同浓度(50、100、200μM)双氧水(H_2O_2)染毒培养的hei-oc1细胞(染毒组),对照组细胞加入无药物培养液,24h后检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活... 详细信息

目的观察氧化应激损伤对hei-oc1细胞Prestin表达的影响,探讨感音性聋的发生机制。方法采用不同浓度(50、100、200μM)双氧水(H_2O_2)染毒培养的hei-oc1细胞(染毒组),对照组细胞加入无药物培养液,24h后检测各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力,实时荧光定量PCR检测Prestin mRNA表达水平,免疫荧光法分析Prestin表达水平。结果与对照组相比,氧化应激损伤后染毒组的hei-oc1细胞SOD活力明显下降,尤以200μM H_2O_2染毒组下降更明显(F=9 926.293,P1);氧化应激损伤的hei-oc1细胞Prestin mRNA和Prestin蛋白表达水平均明显下降,200μM H_2O_2染毒组下降更明显(F=4 065.046、7 657.217,P1)。结论氧化应激损伤可抑制Prestin的表达,此为感音性聋的重要病理学变化。

关键词：氧化应激 hei-oc1细胞 Prestin

siRNA抑制STAT2表达对叔丁基过氧化氢诱导hei-oc1细胞株凋亡影响

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中国职业医学 2019年第5期46卷 581-585页

作者：林寿凯曾梓豪张敏王军义广东药科大学公共卫生学院

目的分析信号传导和转录激活因子2(STAT2)对氧化应激损伤hei-oc1毛细胞株凋亡的影响。方法采用随机数表法将对数生长期hei-oc1毛细胞分为干扰组和未干扰组,干扰组中加入人工设计合成靶向STAT2的小干扰RNA和选择性改良伊格尔培养液(opti-... 详细信息

目的分析信号传导和转录激活因子2(STAT2)对氧化应激损伤hei-oc1毛细胞株凋亡的影响。方法采用随机数表法将对数生长期hei-oc1毛细胞分为干扰组和未干扰组,干扰组中加入人工设计合成靶向STAT2的小干扰RNA和选择性改良伊格尔培养液(opti-MEM),未干扰组中仅加入opti-MEM,分别以不同浓度(0、20、40、60μmol/L)的叔丁基过氧化氢(t-BHP)染毒干扰组和未干扰组。蛋白免疫印迹法检测各组细胞STAT2和半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)相对表达水平,流式细胞仪检测毛细胞凋亡率。结果在未干扰组和干扰组中,hei-oc1细胞的细胞凋亡率和STAT2、Caspase-3的相对表达水平均随t-BHP染毒剂量的升高而升高(Phei-oc1细胞的细胞凋亡率和Caspase-3相对表达水平均升高(P细胞的STAT2表达可导致凋亡程度加重;STAT2具有抗凋亡效应。

关键词： hei-oc1细胞凋亡信号传导和转录激活子2 小干扰RNA

Nrf2/HO-1通路在乙苯致hei-oc1细胞损伤中的效应研究

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Nrf2/HO-1通路在乙苯致HEI-OC1细胞损伤中的效应研究

作者：刘可平广州医科大学

学位级别：硕士

【背景】乙苯是潜在的耳毒性化学物之一,可对听觉外周造成不良影响。与内毛细胞相比,耳蜗外毛细胞对乙苯更为敏感。既往动物实验显示乙苯可导致大鼠听力阈值增加,耳蜗毛细胞减少;同时接触乙苯和噪声的劳动者听力损伤发生率高于单独噪声... 详细信息

【背景】乙苯是潜在的耳毒性化学物之一,可对听觉外周造成不良影响。与内毛细胞相比,耳蜗外毛细胞对乙苯更为敏感。既往动物实验显示乙苯可导致大鼠听力阈值增加,耳蜗毛细胞减少;同时接触乙苯和噪声的劳动者听力损伤发生率高于单独噪声暴露的工人。有研究表明,氧化应激可以上调凋亡相关基因,诱导细胞凋亡。Nrf2/HO-1通路的活化能抑制氧化应激,保护细胞免受损伤。乙苯诱导hei-oc1损伤可能与氧化应激有关,但其中的机制仍有待阐明。【目的】本研究拟探讨乙苯染毒后hei-oc1细胞凋亡情况和Nrf2/HO-1通路中Nrf2、HO-1 m RNA和蛋白表达水平的变化,为乙苯耳毒性和致听力损失的分子机制研究提供实验基础。1.建立乙苯致hei-oc1细胞损伤的体外模型,评估乙苯对细胞氧化损伤和凋亡的影响。2.探究Nrf2/HO-1通路对乙苯诱导hei-oc1细胞损伤的影响及可能机制。【方法】分别设置0、30、60、90、300、600、900μM;3、6、9、10m M共十一个浓度组,CCK-8法测定乙苯染毒24h后hei-oc1细胞增殖活性;以0、1、2、4、8、16、32、64m M乙苯染毒液处理hei-oc1细胞24h,计算乙苯的半数抑制浓度IC50,确定乙苯染毒的适宜浓度用于后续实验。用0、6、9和12m M浓度的乙苯染毒hei-oc1细胞24h后,提取细胞总蛋白,用试剂盒测定细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px酶活力。通过流式细胞仪用Annexin V-APC/PI双染法检测凋亡情况。提取细胞总RNA,经反转录形成c DNA,q PCR实验检测乙苯染毒后细胞内Nrf2、HO-1 m RNA的表达。用蛋白印迹实验测定hei-oc1细胞Nrf2、HO-1蛋白的表达水平。【结果】1.乙苯对hei-oc1细胞的半数抑制浓度为12.86m M(R2=99.05)。随着乙苯染毒浓度的增加,细胞存活率下降。2.DMF≥90μM可抑制hei-oc1细胞增殖,与对照组相比,差异具有统计学意义(Phei-oc1细胞存活率高于9m M乙苯染毒组,差异具有统计学意义(P1)。3.以0、6、9、12m M乙苯处理hei-oc1细胞24h,丙二醛含量分别为72.13±10.55、82.21±5.43、101.4±5.25和163.1±11.76nmol/mgprot,差异具有统计学意义(F=65.11,P1);两两比较结果显示,除了6和9m M浓度组,其他各组均数差异均具有统计学意义(P14、25.14±0.68、28.26±3.09和21.44±3.02 U/mgprot,差异具有统计学意义(F=6.48,P12m M浓度组与对照组相比,差异具有统计学意义(P1、527.82±7.45、661.95±118.33和354.30±17.50U/mgprot,差异具有统计学意义(F=22.85,P1)。两两比较结果显示,12mmo/L浓度组与6、9mmol/浓度组相比,差异显著(P12m M三个处理组的早期凋亡细胞占比分别增加了2.93倍、4.23倍及6.08倍,差异具有统计学意义(P1);两两比较结果显示,除6m M浓度组与9m M浓度组外,其他组别的差异具有统计学意义(P细胞占比分别增加了2.18倍、3.38倍和5.54倍,差异具有统计学意义(P1)。两两比较结果显示,除对照组与6m M浓度组、6m M浓度组与9m M浓度组外,其他组别的差异具有统计学意义(P12m M的乙苯处理细胞24h后,Nrf2和HO-1 m RNA表达水平显著降低(P12m M浓度组Nrf2m RNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P12mmo/L浓度组Nrf2 m RNA表达水平降低,差异具有统计学意义(P12m M浓度组的HO-1 mRNA表达水平低于对照组,差异具有统计学意义(P12m M浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平差异具有统计学意义(P1蛋白的表达呈下降趋势。两两比较结果显示,与6mmol/L浓度组相比,9、12m M浓度组Nrf2和HO-1蛋白表达水平呈下降趋势,差异具有统计学意义(P细胞早期凋率分别增加了8.05倍和

关键词：乙苯 hei-oc1细胞 Nrf2/HO-1通路氧化损伤凋亡

氧化应激状态hei-oc1细胞Prestin基因表达的转录调控机制研究

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氧化应激状态HEI-OC1细胞Prestin基因表达的转录调控机制研究

作者：罗璇广东药科大学

学位级别：硕士

目的噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)是最常见的职业病之一,氧化应激产生的高水平活性氧(氧自由基,reactive oxygen species,ROS)不仅是NIHL耳蜗毛细胞损伤的重要机制,也是多种感音性耳聋的基本病理基础。Prestin蛋白... 详细信息

目的噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)是最常见的职业病之一,氧化应激产生的高水平活性氧(氧自由基,reactive oxygen species,ROS)不仅是NIHL耳蜗毛细胞损伤的重要机制,也是多种感音性耳聋的基本病理基础。Prestin蛋白是耳蜗外毛细胞所特有的重要感音功能蛋白,是动物毛细胞电运动及耳蜗放大效应的分子基础。本研究通过探索氧化应激状态下ROS对毛细胞株hei-oc1(House Ear Institute-Organ of Corti 1)Prestin表达的影响及氧化应激状态下Prestin基因的转录调控分子机制,为NIHL的防治提供理论依据。方法用含四种不同浓度(0μM、50μM、100μM、200μM)叔丁基过氧化氢(t-BHP)的培养基培养hei-oc1细胞24 h或48 h,构建氧化应激损伤细胞模型;用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western Blot)测量氧化应激状态下hei-oc1细胞Prestin在mRNA与蛋白质水平的表达量,观察氧化损伤对其表达的影响;reverse ChIP(反向染色质免疫共沉淀)与液相色谱-质谱联用(LC-MS)实验技术识别Prestin基因启动子区域结合蛋白,并从中筛选出具有转录调控作用的转录因子,根据各转录因子在氧化应激状态下mRNA的表达水平变化量,确定最重要的参与Prestin基因转录调控的转录因子并进行后续验证;染色质免疫沉淀联合定量PCR实验(ChIP-qPCR)被用来验证转录因子与Prestin基因是否可相互结合;针对转录因子设计3条siRNA(small interfering RNA)片段转染至hei-oc1细胞内,筛选出干扰效果最好的siRNA片段,再对比转录因子沉默组与对照组Prestin的表达变化判断转录因子对Prestin基因的调控作用。结果氧化应激状态下hei-oc1细胞Prestin蛋白表达量随t-BHP染毒浓度的增加而降低(24 h:F=201.541,P151.169,P125,Phei-oc1细胞行reverse ChIP实验识别出与Prestin基因启动子区域相结合的蛋白共183种,其中具有转录调控作用的转录因子共8个。氧化应激损伤细胞模型检测这8种转录因子的mRNA表达情况,结果显示AP-2δmRNA表达量变化与Prestin mRNA表达变化间的相关性最强;ChIP-qPCR证明转录因子AP-2δ可与Prestin基因的转录起始位点-1441直接相结合,siRNA实验显示当hei-oc1细胞AP-2δ被抑制时Prestin mRNA和Prestin蛋白表达量均明显升高(mRNA:t=-279.292,Phei-oc1细胞Prestin蛋白由于被ROS破坏而表达量降低,Prestin mRNA表达量呈现反馈性的增加,转录因子AP-2δ是调控Prestin基因表达的重要转录因子,可与Prestin基因的启动子区域结合,且对Prestin基因表现为负调控作用,同时氧化应激状态下hei-oc1细胞AP-2δ表达量降低。结果提示氧化应激状态下hei-oc1细胞Prestin mRNA反馈性地表达增强以弥补蛋白水平的降低,即在氧化应激状态下Prestin呈代偿性机制表达,转录因子AP-2δ表达下调以减弱对其靶基因Prestin的抑制作用,进一步促进Prestin mRNA的表达以补偿性机制增加Prestin蛋白的表达水平维持细胞的正常功能。研究结果不仅丰富了Prestin的分子调控机制,而且也为NIHL的机制提供了新的观点,AP-2δ也可能成为修复NIHL耳蜗外毛细胞损伤的作用靶点。

关键词：噪声性听力损失氧化应激转录调控 Prestin hei-oc1细胞