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hcv核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响

第三军医大学学报 2013年第6期35卷 482-486页

作者：谢艳黄世峰曹炬张莉萍重庆医科大学附属第一医院检验科重庆400016

目的利用腺病毒表达系统,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,hcv)核心蛋白对HepG2细胞增殖、Wnt1以及microRNA152(miR-152)表达水平的影响。方法通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-hcvcore,分别感染HepG2细胞后,通过RT... 详细信息

目的利用腺病毒表达系统,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,hcv)核心蛋白对HepG2细胞增殖、Wnt1以及microRNA152(miR-152)表达水平的影响。方法通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-hcvcore,分别感染HepG2细胞后,通过RT-PCR和Western blot证实hcv核心蛋白在HepG2细胞中高效表达。MTT法、细胞周期测定和克隆形成实验检测hcv核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响。SYBR探针荧光定量PCR和Western blot检测的HepG2-hcv core细胞中Wnt1和miR-152表达的变化。用miR-152 inhibitor转染HepG2细胞后,SYBR探针荧光定量PCR、Western blot检测HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达水平变化。结果 Ad-GFP和Ad-hcv core腺病毒经HEK293扩增后滴度分别为1.5×109pfu/mL和1.6×1010pfu/mL。Ad-hcv core腺病毒感染HepG2细胞后,hcv核心蛋白高效表达。感染48 h后,与HepG2-Mock细胞相比,Ad-hcv core可显著促进HepG2细胞增殖(Phcv core腺病毒感染可在显著上调HepG2细胞中Wnt1mRNA和蛋白表达量(P蛋白水平。进一步生物信息学分析显示,Wnt1基因mRNA 3'-UTR含有miR-152结合位点。结论 hcv核心蛋白可能通过抑制miR-152而减弱其对Wnt1 mRNA的降解及翻译阻碍作用,进而达到上调Wnt1致Wnt信号通路激活,促进肝癌细胞增殖的效应。

关键词： hcv核心蛋白 Wnt1 miR-152 HepG2细胞系

hcv核心蛋白对HepG2细胞microRNA表达谱的影响

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基础医学与临床 2012年第6期32卷 618-622页

作者：吴燕曹炬黄世峰文阳安张莉萍重庆医科大学附属第一医院检验科重庆400016

目的分析hcv核心蛋白(hcv-Core)对HepG2细胞microRNA表达谱的影响。方法将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/hcv-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染hcv-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-hcv Core细胞系。然后用反转录... 详细信息

目的分析hcv核心蛋白(hcv-Core)对HepG2细胞microRNA表达谱的影响。方法将构建好的重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/hcv-Core用脂质体转染HepG2细胞,经G418筛选得到稳定转染hcv-Core的HepG2细胞,命名为HepG2-hcv Core细胞系。然后用反转录聚合酶链反应(RT-PCR),细胞免疫荧光和Western blot对hcv核心蛋白在HepG2细胞里mRNA和蛋白水平的表达情况进行验证。利用博奥生物公司的miRNA Array基因芯片,分析稳定表达hcv核心蛋白的HepG2细胞和转染空质粒pCDNA3.1(+)的HepG2细胞二者microRNA表达谱的差异,最后用Taqman探针荧光定量PCR法进行验证。结果感染hcv-Core后,HepG2细胞表达有差异的microR-NA有8种,用Taqman探针荧光定量PCR法进行分析,发现hcv核心蛋白可以上调miR-29、miR-146a、miR-149、miR-192、miR-221、miR-222和miR-193b,下调miR-196a。结论 hcv核心蛋白可以诱导肝细胞microRNA表达谱发生改变,在肝癌发生发展过程中发挥重要作用。

关键词： hcv核心蛋白 HepG2细胞 MicroRNAs 基因芯片

hcv核心蛋白对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响

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郑州大学学报（医学版） 2013年第3期48卷 310-313页

作者：李志勤孙长宇余祖江黄建敏李建生张毅郑州大学第一附属医院感染科郑州450052 郑州大学第一附属医院生物细胞治疗中心郑州450052 郑州大学第一附属医院消化内科郑州450052

目的:观察hcv核心蛋白对低侵袭性人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响。方法:将hcv核心蛋白的原核表达质粒pcDNA3.0-C-EGFP转染SMMC-7721细胞,以空质粒pcDNA3.0(-)转染的细胞作对照。分别采用RT-PCR、Western blot和ELISA法检测转染细胞HC... 详细信息

目的:观察hcv核心蛋白对低侵袭性人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响。方法:将hcv核心蛋白的原核表达质粒pcDNA3.0-C-EGFP转染SMMC-7721细胞,以空质粒pcDNA3.0(-)转染的细胞作对照。分别采用RT-PCR、Western blot和ELISA法检测转染细胞hcv核心蛋白mRNA、蛋白及培养上清中蛋白的表达水平;进行纤维连接蛋白黏附实验、侵袭实验及运动实验,MTT法观察细胞增殖情况。结果:重组质粒pcDNA3.0-C-EGFP转染的SMMC-7721细胞hcv核心蛋白mRNA、蛋白及培养上清中蛋白的表达水平,细胞黏附率,侵袭实验及运动实验穿膜细胞数均高于对照(t=8.141、5.762、19.931、2.961、4.112和4.213,P均hcv核心蛋白外源基因可促进SMMC-7721细胞系的增殖。

关键词：肝癌 SMMC-7721 hcv核心蛋白

hcv核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测

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第四军医大学学报 2006年第3期27卷 241-244页

作者：刘敏张伟陈天艳蔺淑梅刘锦锋叶峰赵英仁张树林西安交通大学医学院第一附属医院传染科陕西西安710061 第四军医大学基础部微生物学教研室陕西西安710033

目的检测用含丙型肝炎病毒(hcv)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法PCR扩增含hcv核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆... 详细信息

目的检测用含丙型肝炎病毒(hcv)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法PCR扩增含hcv核心蛋白不同大小的cDNA片段,分别克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中.将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用.结果成功获得含hcv核心蛋白的cDNA片段,hcv核心蛋白对酵母菌AH109无毒性,且对报告基因无激活作用.结论利用酵母双杂交Gal4系统3研究与hcv核心蛋白相互作用的蛋白,证实了hcv核心蛋白无自激活功能.

关键词： hcv核心蛋白酵母双杂交报告基因

hcv核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用

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第四军医大学学报 2008年第7期29卷 588-591页

作者：陈云茹刘敏陈天艳张树林陈瑞琳张曦石磊西安交通大学医学院第一附属医院传染科陕西西安710061

目的:探讨hcv-core与HCBP1的相互作用.方法:PCR分别扩增含hcv core及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEM T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果:CAT-... 详细信息

目的:探讨hcv-core与HCBP1的相互作用.方法:PCR分别扩增含hcv core及HCBP1的cDNA片段,克隆入pGEM T载体,经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中,并转染入COS-7细胞,48 h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果:CAT-ELISA检测显示pM-core与pVP16-HCBP1实验孔A405 nm值为0.1288,高于其它阴性对照,但低于阳性对照组A值.结论:哺乳双杂交系统证实hcv核心蛋白与新基因HCBP1有一定的相互作用,可进一步研究HCBP1的细胞功能.

关键词： hcv核心蛋白哺乳双杂交报告基因

hcv核心蛋白对人Huh7肝癌细胞mRNA，lncRNA和circRNA表达的影响及其致癌机制初探

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HCV核心蛋白对人Huh7肝癌细胞mRNA，lncRNA和circRNA表达的影响及...

作者：彭杰夫东南大学

学位级别：硕士

研究背景：丙型肝炎病毒(hcv)与慢性肝炎,肝硬化和原发性肝癌(HCC)的形成密切相关。核心蛋白作为构成hcv衣壳蛋白的结构蛋白,是hcv最重要的成分之一,其参与了包括hcv的免疫逃逸,因hcv感染导致的肝纤维化和HCC等肝脏疾病和抵抗药物治疗... 详细信息

研究背景：丙型肝炎病毒(hcv)与慢性肝炎,肝硬化和原发性肝癌(HCC)的形成密切相关。核心蛋白作为构成hcv衣壳蛋白的结构蛋白,是hcv最重要的成分之一,其参与了包括hcv的免疫逃逸,因hcv感染导致的肝纤维化和HCC等肝脏疾病和抵抗药物治疗等过程。HCC作为一种高致死率的恶性肿瘤,近年来发病率持续升高,而细胞周期异常,凋亡抵抗和癌基因及相关通路的激活是其发生的主要分子机制。非编码RNA (ncRNA)是不编码蛋白质的RNA的总称,其中的长非编码RNA (lncRNA)是近年来生物医学研究的热点内容,其参与了生物生长发育和包括HCC在内的诸多疾病发病过程。新近发现的环状RNA(circRNA)由于其独特的结构和具有的如吸附miRNA以及参与癌症发生发展的相关信号通路等生物学功能,得到了越来越多的关注。已报道发现,有lncRNA参与到了乙型肝炎病毒(HBV)导致的肝癌中,例如HBV的HBx蛋白能下调lncRNA-Dreh从而促进肿瘤的生长和转移。但hcv或者其核心蛋白通过调控lncRNA分子导致HCC的研究却极为鲜见,考虑到hcv与HBV的相似性,可以推测hcv或者hcv核心蛋白导致HCC的过程中可能有lncRNA分子的参与。此外,circRNA在疾病诊断和治疗中的具有巨大的研究与应用前景,基于以上研究背景,本研究开展了如下工作：研究目的：以hcvIb基因型核心蛋白作为研究对象,探讨hcv核心蛋白对人Huh7肝癌细胞nRNA、lncRNA(?)circRNA表达的影响的研究,并初步分析hcv核心蛋白导致的HCC致癌的相关分子机制。研究方法：构建重组表达载体PEGFP-Core (hcv核心蛋白为基因型为lb),将该重组表达载体和空载体PEGFP-C1分别转染Huh7细胞,经G418筛选稳定转染细胞株并用RT-PCR检测核心蛋白的表达。在抽提RNA后通过lncRNA芯片和环状RNA(circRNA)芯片分析得到hcv核心蛋白表达对Huh7细胞基因表达谱的影响情况。随后找出表达差异>2.0的lncRNA分子和circRNA分子,通过生物信息学分析,找出这些变化的分子与相关生理病理改变的关联性;并同时结合阅读文献和利用相关分子靶位点预测平台,挑选相关基因并给出预测的可能致癌通路,对其中的相关基因的差异表达情况进qPCR验证,最后通过构建相关相关基因的重组表达载体并瞬时转染Huh7-core细胞克隆,从而进一步对相关的信号通路进行探究。研究结果：LncRNA芯片包含两个部分,其中lncRNA检测部分含有30586个基因位点,mRNA检测部分含有26109个基因位点。结果显示,与对照组相比,有4851个lncRNA表达上调和3569个lncRNA表达下调超过2倍;4785个mRNA表达上调和3192个1nRNA表达下调超过对照组基因表达2倍。CircRNA芯片(含有5396个位点),分别发现了823个基因表达上调和419个基因表达下调超过对照组基因表达2倍。通过聚类分析和GO分析发现,这些分子参与了包扩细胞内大分子代谢,核酸代谢等代谢过程以及DNA损伤反应,钙离子通道调控等生化反应。通过KEGG Pathway分析,这些分子与内质网应激,凋亡,钙离子信号途径,Wnt信号途径,HBV, hcv感染等信号通路存在关联。此外经过qPCR验证了预测的信号通路中高表达或低表达的10个相关分子。最后通过构建信号通路中的相关分子(miR122, miR192, miR204)的基因表达载体,探讨了其表达对通路中其它分子可能的调控作用。结论：miR204-HPCALl, HOTTIP-GLS,和Circ0001498-miR122-TGFBRAP1这两条信号通路可能与hcvlb基因型核心蛋白参与hcv感染所致的HCC相关过程存在关联。

关键词： hcv核心蛋白原发性肝癌 RNA芯片 lncRNA circRNA

抑制性RNA对细胞内hcv IRES介导hcv核心蛋白表达抑制作用的定量分析

同方学位论文库评论

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中华传染病杂志 2004年第1期22卷 5-7页

作者：梁雪松周永兴连建奇贾战生聂青和第四军医大学唐都医院感染病科西安710038

目的　定量观察核糖体内部进入位点 (Internalribosomeentrysite ,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitorRNA ,IRNA)对细胞内hcvIRES介导的hcvC基因表达的抑制作用。方法　构建IRES特异性IRNA的真核表达载体 (pcRz IRNA) ,将该质粒与 pchcvcl... 详细信息

目的　定量观察核糖体内部进入位点 (Internalribosomeentrysite ,IRES)特异性抑制性RNA(inhibitorRNA ,IRNA)对细胞内hcvIRES介导的hcvC基因表达的抑制作用。方法　构建IRES特异性IRNA的真核表达载体 (pcRz IRNA) ,将该质粒与 pchcvcluc(含hcv 5′非编码区、核心区与荧光素酶基因 )共转染人肝细胞癌 (HHCC)细胞株 ,对转染后 72h细胞表达hcvC抗原进行间接免疫荧光染色 ,用激光共聚焦显微镜对其含量进行定量分析。用荧光素酶检测试剂盒对其活性进行检测。结果　共转染细胞可表达hcvC抗原 ,同对照组相比 ,IRNA组荧光量明显下降。结论　在IRNA与hcv共转染细胞中 ,IRNA对hcvIRES介导蛋白翻译具抑制作用。

关键词：抑制性RNA 细胞 hcvIRES 介导 hcv核心蛋白表达抑制作用定量分析

用T7噬菌体展示技术筛选hcv核心蛋白的相互作用蛋白

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第三军医大学学报 2007年第10期29卷 876-878页

作者：黄英蔡雪飞张君黄爱龙重庆医科大学附属第二医院感染科重庆400016 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部省部共建重点实验室重庆400016

目的用T7噬菌体筛选系统筛选hcv核心蛋白的相互作用蛋白。方法应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到hcv的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果经鉴定得到... 详细信息

目的用T7噬菌体筛选系统筛选hcv核心蛋白的相互作用蛋白。方法应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到hcv的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与hcv核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1)。结论T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据。

关键词： T7噬菌体展示技术 hcv核心蛋白相互作用蛋白

用细胞爬片和石蜡切片对hcv核心蛋白进行免疫组化染色的比较

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第3期21卷 392-392,397页

作者：王文勇邓南生张志培赵一岭马福成第四军医大学西京医院病理科陕西西安710032 西安市北方医院病理科陕西西安710043

用培养的细胞进行免疫组化染色时,可采用两种方法:细胞爬片和石蜡切片.虽然细胞爬片具有方便、快捷等优点,但也受到一定的限制.如抗体的结合部位位于细胞核时,由于细胞膜的障碍、穿透效果不佳;贴壁不牢的细胞在染色振洗过程中可发生脱落... 详细信息

用培养的细胞进行免疫组化染色时,可采用两种方法:细胞爬片和石蜡切片.虽然细胞爬片具有方便、快捷等优点,但也受到一定的限制.如抗体的结合部位位于细胞核时,由于细胞膜的障碍、穿透效果不佳;贴壁不牢的细胞在染色振洗过程中可发生脱落.这样不仅可降低检测的敏感性,甚至可出现假阴性的结果.而用细胞石蜡切片则可克服上述缺点,扩大检测的范围.本研究中,我们将培养的肝癌细胞株HepG2分别制作成细胞爬片和石蜡切片,用抗hcv核心蛋白的mAb做免疫组化染色,检测了hcv核心蛋白的表达,并对两种标本片检测的结果进行了比较.

关键词： HegG2细胞株 hcv核心蛋白免疫组化染色