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ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性影响

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中国动物传染病学报 2024年

作者：潘晟辉牛世奇王晨阳吕雪华张志飞许榜丰滕巧泱闫大为苑纯秀李泽君刘芹防中国农业科学院上海兽医研究所

为了评价ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白免疫原性的影响，本研究将ha蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为ha-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/ha的重组火... 详细信息

为了评价ha蛋白裂解位点突变对H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白免疫原性的影响，本研究将ha蛋白裂解位点从PSRSSR↓GLF突变为TSNSS↓GLF，引入了两个N-糖基化位点，将其命名为ha-2N。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建出两株表达H9/ha的重组火鸡疱疹病毒（rHVT-ha和rHVT-ha-2N），通过间接免疫荧光实验鉴定重组病毒中的外源蛋白H9/ha均可以正确表达，Western Blot结果显示经过裂解位点改造后的ha蛋白不发生裂解，说明缺失裂解位点后，ha蛋白不能正常裂解为ha1与ha2蛋白，保持了融合前状态。将重组病毒分别免疫SPF鸡，采集血清进行H9抗体效价的监测，结果显示，针对ha蛋白裂解位点改造过的重组病毒可以在宿主体内诱导免疫应答，但是抗体效价低于带有裂解位点的重组病毒，此结果说明了ha蛋白裂解位点突变明显降低了基于HVT载体的H9N2亚型禽流感疫苗免疫原性。本研究对H9N2亚型禽流感疫苗设计与免疫效力评估具有参考意义。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 ha蛋白裂解位点火鸡疱疹病毒

共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感病毒ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒的构建及免疫效果评价

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畜牧兽医学报 2024年第5期55卷 2123-2134页

作者：吕亚迪杨洁谢文婷徐婷陈瑞爱华南农业大学兽医学院广州510642 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心肇庆526238 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司肇庆526238 肇庆大华农生物药品有限公司肇庆526238

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF... 详细信息

旨在构建能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的重组基因Ⅶ型新城疫病毒,有望开发抗新城疫和H9N2亚型禽流感病毒的二联疫苗,为控制H9N2 AIV和NDV提供新的防御思路,对NDV疫苗载体的构建和优化有重要的参考意义。利用反向遗传技术,以rDHN3-mF为骨架,在病毒基因组的P和M之间的非编码区插入全长膜结合ha和另外一个带有截短跨膜结构域的可溶性ha蛋白,获得了能高效稳定表达H9N2 AIV的ha蛋白的基因Ⅶ型NDV减毒株重组病毒rDHN3mF-ha和rDHN3mF-2ha。通过鸡胚接种、Western blot、血凝效价(ha)及平均鸡胚致死时间(MDT)等试验来检测重组病毒的稳定性以及生物学特性,将重组病毒以10~6 EID_(50·)只^(-1)剂量免疫7日龄SPF鸡并测定血凝抑制(HI)抗体,在免疫后28 d对各组进行攻毒保护试验。结果显示:重组病毒在鸡胚中连续传至十五代后ha基因无突变发生;Western blot证明重组病毒可稳定高效地表达特异性的ha蛋白;重组病毒的生长曲线说明了重组病毒与亲本毒株具有相似的复制特性和低毒力特征;重组病毒免疫组的SPF鸡均能产生针对NDV或者H9N2 AIV的特异性HI抗体;攻毒保护试验结果:重组病毒均能对攻毒后的鸡产生100%保护效果;喉、肛拭子检测结果说明重组病毒可显著减少NDV与H9N2 AIV的体外排毒;气管与肺qPCR检测结果显示攻毒后3 d, rDHN3mF-2ha较rDHN3mF-ha更显著地降低了脏器中H9N2 AIV含量。本研究成功构建了共表达膜结合型与可溶性H9N2亚型禽流感ha蛋白的基因Ⅶ型重组NDV,为H9N2 AIV和NDV的一种新型重组基因工程二联活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

关键词： H9N2亚型禽流感病毒 ha蛋白新城疫病毒免疫原性载体疫苗免疫保护效率

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H5N8亚型禽流感病毒ha蛋白的原核及真核表达及兔多克隆抗体的制备

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中国病原生物学杂志 2024年第7期19卷 745-750页

作者：刘静王聪颖梁志鹏梁昭平刘闰栀张新宇何杰珩陈高婕闫战飞池仕红袁生郭锦玥黄淑坚温峰佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东佛山528225 华南农业大学兽医学院

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)ha基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的ha基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-P... 详细信息

目的构建H5N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)ha基因的原核和真核表达载体,分别在*** Rosetta(DE3)和Sf9中进行表达,并制备兔多克隆抗体。方法采用RT-PCR扩增H5N8亚型AIV的ha基因,并将其克隆至原核表达载体pTac-His-MBP-PreScission中,再转化至Rosetta(DE3)中,利用IPTG诱导表达。通过SDS-PAGE及蛋白免疫印迹(Western blot, WB)鉴定ha蛋白的表达,并优化IPTG浓度、诱导时间和温度以提高表达效率。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗H5N8亚型AIV的ha蛋白多克隆抗体,通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其特异性和效价。同时,将ha基因克隆到真核表达载体pFastBacHTA中,将其瞬时转染Sf9细胞并扩增3代,最后通过WB和间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence assay, IFA)验证表达产物。结果成功构建了ha基因的原核重组质粒pTac-ha-DE3和真核重组质粒pFast-ha。经SDS-PAGE及WB验证该蛋白分子质量约110 ku,最佳表达条件为IPTG浓度为0.8 mmol/L、温度37℃和诱导时间为4 h。ELISA检测显示兔多克隆抗体效价为1∶102 400。成功将真核重组质粒pFast-ha转化入DH10Bac感受态细胞中,证明ha基因成功转座。Bacmid-ha转染Sf9细胞后观察到细胞病变,WB和IFA检测表明重组杆状病毒Bac-ha感染的Sf9细胞能够表达ha蛋白。结论本研究初步探究了H5N8亚型AIV ha蛋白的表达条件及免疫原性,并且具有良好的免疫原性和反应原性,为后续建立ELISA诊断试剂盒及H5N8 AIV疫苗的研制提供了一定的参考价值。

关键词：禽流感病毒 H5N8亚型 ha蛋白原核表达真核表达多克隆抗体

H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白在水稻胚乳中的表达及其纯化

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河南农业科学 2024年第3期53卷 125-132页

作者：屈小天王雅楠许倩茹李雪洋张申立张二芹张改平河南农业大学生命科学学院河南郑州450046 吉林大学动物医学院吉林长春130062 河南农业大学动物医学院/国家动物免疫学国际联合研究中心河南郑州450046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002

为制备H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组ha蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-ha,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将... 详细信息

为制备H5N1亚型禽流感病毒ha蛋白并评估其免疫原性,利用水稻表达系统表达H5N1亚型禽流感病毒重组ha蛋白。首先构建了重组植物表达载体pCAMBIA1300-ha,该载体具有GT13特有启动子、信号肽SP和终止子,有利于外源基因在水稻中表达。之后将重组质粒pCAMBIA1300-ha通过电转化法导入根癌农杆菌Eha105中,筛选出阳性菌落并侵染水稻愈伤组织。经过暗培养、潮霉素筛选、分化、生根、成苗,采用CTAB法提取水稻叶片DNA,PCR鉴定结果显示,ha基因已插入到水稻基因组中,重组ha基因大小为4660 bp。将阳性植株移植到大田中,4个月后收获水稻种子,提取水稻胚乳蛋白,Western blot鉴定结果表明,ha蛋白在水稻胚乳中成功表达。重组ha蛋白通过Q阴离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析三步分离纯化,其纯度达到90%以上。最后将纯化后的重组ha蛋白与ISA 50V佐剂混合并乳化制成疫苗,免疫小鼠,小鼠血清具有较高的特异性抗体水平,表明重组ha蛋白免疫原性较好。综上,成功构建了H5N1亚型禽流感病毒ha重组蛋白的水稻表达系统,并分离纯化获得了高纯度和免疫原性良好的重组ha蛋白。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒 ha蛋白水稻胚乳表达蛋白质纯化

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H1N1亚型猪流感病毒ha蛋白225位氨基酸对病毒致病性的影响

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中国农业科学 2022年第4期55卷 816-824页

作者：杨时鳗许程志许榜丰吴运谱贾云慧乔传玲陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室辽宁中医药大学实验动物中心

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行ha基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流... 详细信息

【目的】流感病毒的致病性是由多个基因共同决定的，笔者之前的研究结果发现当两株具有相似基因特征的H1N1亚型猪流感病毒进行ha基因替换以后，病毒对小鼠的致病性发生了改变。通过确定影响病毒致病性的关键氨基酸位点，为进一步揭示流感病毒致病力差异奠定了基础。【方法】对ZD71和SY130的ha蛋白氨基酸序列进行比对，确认氨基酸差异位点并设计定点突变引物，构建单点突变的重组病毒并测定其鸡胚半数感染量（EID50）。将拯救的亲本病毒、ha单基因替换重组病毒及单点突变重组病毒以感染复数（MOI）为0.001和0.1的病毒量分别接种于MDCK和A549细胞，测定病毒的体外复制能力；将上述各株病毒以50μL含106EID50的剂量经滴鼻途径接种BALB/c小鼠，分别采集小鼠的脑、鼻甲、肺、脾、肾等脏器，匀浆处理后接种鸡胚分析病毒在小鼠体内各脏器的复制情况；将病毒分别以50μL含101-106 EID50的剂量经鼻腔感染BALB/c小鼠，感染后每天称量小鼠体重，当小鼠体重下降比率超过25%时判定为死亡，统计死亡情况，测定病毒的小鼠半数致死量（MLD50），评估各突变病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒进行分析比较后，获知决定病毒致病性的关键氨基酸位点。【结果】ZD71和SY130病毒ha蛋白共存在4个氨基酸差异位点，分别为4、138、144和225位（H3 Numbering）。经过定点突变、病毒拯救及序列测定确认，分别获得含有单个位点突变的重组病毒。通过测定病毒在MDCK和A549细胞上的复制情况，结果发现与亲本病毒rZD71相比较，突变病毒rZD71-ha/G225E在感染MDCK细胞的各检测时间点、及感染A549细胞24—48 h后，复制滴度均显著提高；与rSY130相比较，突变病毒rSY130-ha/E225G在感染MDCK细胞12—36 h后、及感染A549细胞36—72 h后，复制滴度均显著降低。而4、138、144位点的突变对病毒的复制影响较小。进一步的小鼠感染试验发现ha 225位氨基酸的改变显著影响了病毒对小鼠的致病性，与亲本病毒rZD71相比，225位氨基酸由G突变为E后，病毒rZD71-ha/G225E的MLD50由4.32 log10EID50降低至3.0 log10EID50；病毒不仅在小鼠鼻甲和肺脏内检测到，而且在脾脏和肾脏中也均有一定水平的复制。【结论】ha蛋白225位氨基酸对两株H1N1 SIV对小鼠的致病性具有重要决定作用，提示在后续开展的病原学监测中要密切关注该位点氨基酸的变异情况，为更好地防控动物流感乃至人流感的大流行提供科学依据。

关键词：猪流感病毒 ha蛋白氨基酸致病性

ha蛋白133、158位糖基化及其联合T126K、S145P对H7N9亚型禽流感病毒生物学特性的影响

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HA蛋白133、158位糖基化及其联合T126K、S145P对H7N9亚型禽流感病...

作者：严雅瑶扬州大学

学位级别：硕士

H7N9亚型流感病毒自2013年出现以来,逐渐从对家禽低致病性（Lowly pathogenic,LP）演变为高致病性（Highlypathogenic,HP）,并在人群中造成至少5波流行高峰。当前,LPH7N9禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）已鲜有分离,而HP H7N9AIV仍在我国部分地区持续流行与变异。ha是流感病毒囊膜表面表达丰度最高的糖蛋白及抗原组分,在病毒生命周期中扮演着重要角色。随着病毒不断的演化及变异,ha蛋白关键氨基酸位点的变异也导致了 N-糖基化（N-linked glycosylation,NLG）状态的改变。由于NLG位点的添加或者缺失及其附近的氨基酸变异还可能与糖链存在联合作用,从而影响ha蛋白的功能及病毒的抗原性和致病性等生物学特性,并可能使病毒获得高效传播的能力,具有引起大流行的潜在风险。因此,密切监测H7N9亚型AIV ha蛋白适应性氨基酸变异及其导致的NLG状态改变至关重要。1.2016～2021年H7N9亚型流感病毒ha蛋白位点变异分析及点突变重组病毒的构建首先通过检索GISAID数据库并结合本实验室数据,对2016～2021年HP H7N9流感病毒ha基因进行氨基酸位点变异的统计分析,同时经DTU Health Tech在线工具对NLG位点变异进行分析。结果显示,H7N9亚型流感病毒的ha蛋白头部受体结合口袋区有4个氨基酸位点呈现规律性变异:T126K、V135T、S145P、A160T（H3编号）,其中V135T、A160T还导致133、158新增为潜在NLG位点。然后,选取ha133与158位均无NLG修饰的HPH7N9亚型AIV（GX110）为母本病毒,通过定点突变和反向遗传学技术构建出4种不同 NLG 模式的点突变病毒,即 rGX110、rGX110-133N、rGX110-158N 和 rGX110-133N＆158N。Western blot结果显示,相较于母本rGX110,另外3株点突变病毒的ha0、ha1蛋白分子量均增大,表明存在相应位点的NLG修饰;EID50、TCID50结果表明该3株点突变病毒在鸡胚和细胞上的复制能力也获得增强。接下来,进一步以rGX110与rGX110-133N＆158N作为骨架病毒,分别在其ha基因上引入T126K、S145P单点/联合突变,成功拯救出 6 株点突变病毒:rGX110-126K、rGX110-145P、rGX110-126K＆145P,rGX110-133N＆158N-126K、rGX110-133N＆158N-145P 和 rGX110-133N＆158N-126K＆145P。结果显示S145P可明显增强病毒在细胞及鸡胚上的复制能力;且值得注意的是rGX110-133N＆158N及其点突变病毒的ha血凝价、EID50、TCID50普遍高于母本病毒rGX110骨架的点突变病毒,再次表明目前ha蛋白上具有133与158位双NLG修饰的H7N9病毒可能具有一定的竞争优势而促进其流行。***蛋白133、158位糖基化对HP H7N9亚型禽流感病毒生物学特性的影响为了明确HP H7N9病毒ha蛋白头部新出现133与158位NLG修饰的是否增强病毒的竞争优势,本研究对第一章中的4株不同NLG模式点突变病毒rGX110、rGX110-133N、rGX110-158N和rGX110-133N＆158N进行了生物学特性的比较。通过将病毒在不同pH值缓冲液处理一定时间、56℃处理不同时间后,发现ha蛋白133N与158N可增强病毒酸、热稳定性。Western blot试验结果显示rGX110-133N＆158N毒株haO裂解时间提前,ha1表达量增加。病毒在不同种属细胞上的生长曲线结果显示,ha蛋白133、158位NLG添加可提高病毒在CEF、MDCK、A549细胞上的复制能力,尤以rGX110-133N＆158N的增幅最强。受体结合特性的测定结果显示,4株病毒仍均表现α2,3＆α2,6的双受体特性,但rGX110-133N＆158N对α2,6的亲和力明显降低。进一步的病毒吸附能力测定结果显示,ha蛋白携带有158位糖基化的2株病毒:rGX110-158N、rGX110-133N＆158N对CEF和A549细胞的吸附能力均减弱;而豚鼠红细胞解凝试验结果显示这2株病毒均具有更强的ha-NA匹配性。在SPF鸡模型中,ha蛋白携带有133N的rGX110-133N和rGX110-133N＆158N病毒表现为体内复制能力及排毒水平的提升,而ha-158N则导致病毒呈现较母本更弱的鸡体内复制性、排毒能力及致病性。在BALB/c小鼠模型中,具有单点或双点NLG修饰的3株病毒其体内复制性均获得增强,而致病能力则出现不同程度的减弱;

关键词：禽流感 H7N9 ha蛋白糖基化感染与致病

稳定表达H7N9亚型禽流感病毒ha蛋白的293T细胞株构建及应用

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中国家禽 2023年第10期45卷 59-64页

作者：曹永忠邓婧黄雅薄宗义胡增垒扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009 扬州大学农业农村部畜禽传染病学重点开放实验室江苏扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室江苏扬州225009

为获得用于评价H7N9亚型禽流感疫苗诱导的抗体Fc免疫效应的靶细胞,研究采用慢病毒包装与感染技术构建一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)ha蛋白的细胞株,并以该细胞株为靶细胞建立H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清补体介导的细胞毒(AD... 详细信息

为获得用于评价H7N9亚型禽流感疫苗诱导的抗体Fc免疫效应的靶细胞,研究采用慢病毒包装与感染技术构建一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(H7N9 AIV)ha蛋白的细胞株,并以该细胞株为靶细胞建立H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清补体介导的细胞毒(ADCML)活性的检测方法。结果显示成功包装了一株重组慢病毒,滴度可达108 FU/mL;构建了稳定表达H7N9 AIV ha蛋白的293T细胞株,ha蛋白主要在细胞膜上表达。基于新城疫病毒(NDV)载体的H7N9亚型禽流感疫苗免疫鸡后,诱导产生的ha结合性IgG抗体滴度为2180。以稳定细胞株为靶细胞,载体疫苗血清诱导的细胞死亡水平显著高于空载体与未免疫鸡血清(Pha蛋白的细胞株可作为评价H7N9亚型禽流感疫苗免疫血清Fc免疫效应的靶细胞。

关键词： H7N9亚型禽流感 ha蛋白稳定细胞株疫苗 Fc免疫效应补体抗体保护

表达H9N2 AIV双脯氨酸突变ha蛋白的基因Ⅶ型重组NDV的构建及鉴定

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中国兽医学报 2023年第7期43卷 1381-1387页

作者：谢文婷徐婷杨洁陈瑞爱岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院广东广州510642 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司广东肇庆526238 肇庆大华农生物药品有限公司广东肇庆526238

构建表达H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenzavirus, H9N2 AIV)双脯氨酸突变的ha蛋白的基因Ⅶ型重组新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV),为NDV和H9N2 AIV新型二联疫苗的研发提供前期基础。通过对H9N2亚型AIV的ha基因进行分析,将其编码区第403位氨基酸由I突变为P以及第411位氨基酸由V突变为P,并利用反向遗传操作系统,将突变前与双脯氨酸突变的ha插入到基因Ⅶ型NDV病毒弱毒株rDHN3-mF基因组P基因与M基因之间的非编码区,经病毒拯救后获得重组病毒(rDHN3mF-ha/ha-2P)。通过Western blot试验证明重组病毒rDHN3mF-ha-2P可在DF1细胞内表达特异性ha蛋白,且与rDHN3mF-ha相比,经双脯氨酸突变后的ha蛋白表达水平更高。重组病毒rDHN3mF-ha-2P可以在鸡胚中稳定传代,与亲本毒株具有相似的复制特性,保留了rDHN3-mF株在鸡胚中高滴度复制、低致病性等生物学特性。本试验成功构建表达H9N2亚型AIV的双脯氨酸突变ha基因的重组病毒rDHN3mF-ha-2P,将为研发同时防控H9N2亚型AIV毒株和基因Ⅶ型NDV感染的新型高效、廉价多联疫苗奠定基础。

关键词： H9N2亚型禽流感 ha蛋白脯氨酸突变新城疫病毒反向遗传系统

H5亚型禽流感病毒ha蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的表达与纯化

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动物医学进展 2023年第10期44卷 19-24页

作者：刘郁夫陈晓洁区炳明容芳郝文茜陈瑞爱肇庆学院生命科学学院广东肇庆526060 华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司广东肇庆526238 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心广东肇庆526238 华南农业大学兽医学院广东广州510642

为表达H5亚型禽流感病毒ha蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-ha重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组ha基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表... 详细信息

为表达H5亚型禽流感病毒ha蛋白研制亚单位疫苗,构建了pFastBAC-ha重组质粒,转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组ha基因的杆状病毒质粒,再将重组杆状病毒质粒转染至Sf9细胞,拯救重组病毒,通过间接免疫荧光和Western blot试验对Sf9细胞中表达的ha蛋白进行鉴定。结果表明表达的重组ha蛋白均能与抗Strep标签抗体、H5亚型禽流感病毒阳性血清(Re-11株)特异性结合,且ha重组蛋白在昆虫细胞中以细胞分泌上清的形式表达,红细胞凝集效价为1∶64,利用链霉素亲和层析的方法,纯化重组ha蛋白,纯化后ha蛋白浓度为0.364 mg/mL。试验结果可为禽流感病毒亚单位疫苗研制、ha蛋白单克隆抗体制备提供前期基础。

关键词： H5亚型禽流感病毒 ha蛋白杆状病毒蛋白表达