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沙门菌工程菌和质粒纳米颗粒序贯免疫对h9n2亚型禽流感免疫的增强效果

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沙门菌工程菌和质粒纳米颗粒序贯免疫对H9N2亚型禽流感免疫的增强...

作者：张晓吉林农业大学

学位级别：硕士

h9n2亚型禽流感(Avian influenza,AI)是一种低致病性禽流感,临床症状较轻,影响家禽的生长发育及降低产蛋率,给家禽业带来了重大经济损失。目前注射疫苗是防治该病的主要手段,而目前市面上流行的大多是灭活疫苗。灭活疫苗以体液免疫为主... 详细信息

h9n2亚型禽流感(Avian influenza,AI)是一种低致病性禽流感,临床症状较轻,影响家禽的生长发育及降低产蛋率,给家禽业带来了重大经济损失。目前注射疫苗是防治该病的主要手段,而目前市面上流行的大多是灭活疫苗。灭活疫苗以体液免疫为主,但在黏膜免疫反应方面有所欠缺。以沙门菌为载体递送质粒DnA可以引起较为全面的免疫反应,为了进一步提高其免疫原性,本研究通过序贯免疫方式用沙门菌口服+质粒滴鼻检测是否能提高免疫效果。在滴鼻免疫实验中,本研究使用壳聚糖包裹以防止质粒DnA降解。本研究的主要内容及结果如下:(1)壳聚糖DnA纳米颗粒的制备、检测及表达验证。本研究所用pYL233是课题组构建的表达h9n2亚型禽流感M1和Mosaic hA蛋白及ch GM-CSF佐剂的质粒DnA。制备过程以壳聚糖为载体材料,Mg SO、TPP作为交联剂,通过离子交联法包裹质粒DnA,检测壳聚糖DnA的结合情况、形态、包封率、Dnase I抗性和稳定性,Western-blot和间接细胞免疫荧光验证pYL233和壳聚糖DnA纳米颗粒(CS233)的体外表达情况。1%琼脂糖凝胶阻滞试验和透射电镜结果表明壳聚糖与质粒DnA成功结合,纳米颗粒粒径大小约为150 nm,且所得包封率93.2±0.12%;1%琼脂糖凝胶结果表明壳聚糖DnA能抗Dnase I降解,在37℃温箱中静置10天仍较为稳定。Western-blot和间接免疫荧光结果表明二者成功表达M1和Mosaic hA蛋白及ch GM-CSF佐剂,其中未经包埋质粒DnA表达效果更佳。(2)沙门菌口服免疫结合壳聚糖DnA纳米颗粒滴鼻序贯免疫效力评价。将质粒pYL233电转至沙门菌χ11218中,得到沙门菌株χ11218(pYL233)。试验分为6组,BSG对照组、χ11218(p YA4545)空载体组、AIV商品化疫苗组、χ11218(pYL233)纯口服试验组(简称S233)、χ11218(pYL233)口服+裸质粒滴鼻试验组(简称P233)及χ11218(pYL233)口服+壳聚糖DnA纳米颗粒滴鼻试验组(简称CS233)。本研究将21日龄蛋鸡作为实验动物(首次免疫记为0天),分别在第0、14、28天免疫雏鸡,其中S233组3次口服沙门菌,P233组2次口服沙门菌+1次滴鼻质粒DnA,CS233组2次口服沙门菌+1次滴鼻壳聚糖DnA纳米颗粒。口服剂量为1×10CFU/羽,滴鼻剂量为50μg/羽。三免后7天,ELISA检测血清Ig Y和肺泡灌洗液s Ig A抗体水平,CFSE法检测脾脏T细胞增殖,CCK8法检测M1、hA和Con A蛋白体外刺激鸡脾脏T细胞增殖,荧光定量PCR检测M1、hA蛋白体外刺激鸡脾细胞中IL-4和IFn-γ的mRnA水平。三免后14天以10TCID h9n2亚型禽流感分离株A3毒株攻毒,每隔一天记录雏鸡的体重变化情况,记录至第14天。在攻毒后的3天,5天,7天每组采集5只雏鸡的口咽棉拭子和泄殖腔棉拭子,通过q PCR检测拭子排毒情况。攻毒后第5天,每组随机取三只雏鸡的肺部检测肺病毒含量及病理学观察。三免后7天ELISA结果显示,与BSG组相比,CS233组血清中hA蛋白Ig Y抗体水平显著升高(P233和P233组抗体水平有升高趋势;CS233组M1蛋白Ig Y抗体水平显著升高(P233组抗体水平极显著升高(P233、CS233和S233组肺泡灌洗液中M1蛋白s Ig A抗体水平有升高趋势。与疫苗组相比,CS233组肺泡灌洗液中hA蛋白s Ig A抗体水平显著升高(P233和P233组抗体水平极显著升高(P233组效果最佳。CFSE法检测脾脏T细胞增殖结果显示,与BSG组相比,P233组CD4CFSET细胞数极显著升高(P233和P233组有升高趋势;P233组CD8CFSET细胞数显著升高(P233和S233组极显著升高(P233和S233组能够显著增强hA蛋白刺激的脾T细胞增殖(P233和S233组能够极显著增强M1蛋白刺激的脾T细胞增殖(P233组能够极显著增强Con A蛋白刺激的脾T细胞增殖(P233组能够显著增强Con A蛋白刺激的脾T细胞增殖(P233组效果最佳。q RT-PCR结果显示,与疫苗组相比,CS233和S233组hA蛋白刺激的IL-4

关键词： h9n2亚型禽流感壳聚糖质粒DnA 序贯免疫

表达h9n2亚型禽流感Mosaic hA蛋白减毒沙门菌构建及序贯免疫效果评价

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表达H9N2亚型禽流感Mosaic HA蛋白减毒沙门菌构建及序贯免疫效果...

作者：张梦蕾吉林农业大学

学位级别：硕士

h9n2亚型禽流感为低致病性型禽流感,对蛋鸡的产蛋量有很大影响。接种疫苗是现在防控禽流感最为有效的方式。目前市场上广泛使用灭活疫苗以应对h9n2亚型流感,其安全性能高、免疫持续时间久,但灭活疫苗主要诱导体液免疫,产生的黏膜免疫较... 详细信息

h9n2亚型禽流感为低致病性型禽流感,对蛋鸡的产蛋量有很大影响。接种疫苗是现在防控禽流感最为有效的方式。目前市场上广泛使用灭活疫苗以应对h9n2亚型流感,其安全性能高、免疫持续时间久,但灭活疫苗主要诱导体液免疫,产生的黏膜免疫较弱,这使得病毒对鸡上呼吸道的感染难以阻断。近年来铁蛋白纳米颗粒作为新型疫苗载体已在人类流感的防治中成功应用,极具前景。本研究主要将禽流感h9n2 Mosaic hA蛋白与具有自组装功能的铁蛋白融合表达形成铁蛋白为核心、Mosaic hA抗原于表面的纳米颗粒,通过延迟裂解型减毒沙门菌口服免疫雏鸡,并结合序贯免疫方式以纯化的纳米颗粒蛋白滴鼻免疫诱导机体产生免疫反应。主要的内容及结果如下:(1)融合表达Mosaic hA与铁蛋白质粒的构建及表达验证本试验将p YL212质粒中Mosaic hA基因序列与p YL264质粒中铁蛋白(Ferritin)序列融合,组成Mosaic hA-Ferritin目的片段,成功构建质粒p YL269。将目的片段分别连接至减毒沙门菌载体和大肠杆菌表达载体并转化入菌株,得到沙门菌χ11802(p YL272)和BL21(p YL288);利用his标签纯化BL21(p YL288)中的目的蛋白。经Western blot试验检测到目的蛋白成功表达,且透射电镜结果证明了纳米粒子的成功组装。(2)表达Mosaic hA蛋白减毒沙门菌口服及纯化蛋白滴鼻序贯免疫方式抗h9n2禽流感病毒效果评价选择1日龄雌性蛋鸡为实验动物,待21天(d)自身抗体水平降低后进行免疫。首免日设定为0d,14d、28d进行二免、三免。将动物分为五组:p YL272口服免疫实验组、p YL272序贯免疫实验组、BSG对照组、p YA4545空载体对照组和商品化疫苗Vaccine组,其中p YL272口服免疫组、BSG组和p YA4545组均以三次口服方式免疫,1×10CFU/100μL/羽,Vaccine组于0d肌肉注射200μL商品化疫苗,p YL272序贯免疫组0d、14d口服1×10CFU沙门菌/100μL/羽,28d将20μg纯化的蛋白滴鼻免疫雏鸡。三免后一周采集血清、肺泡灌洗液检测动物体内抗体水平,收集脾脏T淋巴细胞hA、Con A蛋白刺激后荧光定量PCR法(q RT-PCR)检测细胞因子IL-4和IFn-γ的m RnA水平,通过CCK8法和流式细胞术检测脾脏淋巴细胞增殖情况。42d使用h9n2 AIV A3毒株以1×10TCID进行滴鼻攻毒,攻毒后每间隔一日监测动物体重变化,5d采集血清和肺泡灌洗液检测抗体水平,并采集肺组织以q RT-PCR检测病毒载量,3d、5d、7d采集动物口咽部和泄殖腔拭子检测体外排毒水平。结果表明,三免后一周p YL272口服免疫组和p YL272序贯免疫组血清中Ig Y和黏膜中SIg A抗体水平均有所提高。流式细胞术检测脾脏中T淋巴细胞结果显示p YL272序贯免疫组与BSG组和p YA4545组相比CD8T淋巴细胞数量显著升高(PhA蛋白刺激时,p YL272序贯免疫组与BSG组相比显著增强了脾脏的T淋巴细胞增殖能力(Pn A蛋白体外刺激时,p YL272序贯免疫组比BSG组极显著提高了脾脏的T淋巴细胞增殖水平(P272口服免疫组与p YA4545空载体组相比有升高趋势。脾细胞中细胞因子的m RnA水平检测结果表明p YL272口服免疫组比BSG组明显提高了细胞因子IFn-γ的m RnA水平(P272序贯免疫组与BSG组和p YA4545组相比IL-4和IFn-γ的m RnA水平极显著升高(P272口服免疫组与BSG组和p YA4545组相比黏膜SIg A抗体水平显著提升(P272口服免疫组和p YL272序贯免疫组与BSG对照组比较体内病毒载量有降低趋势。肺组织病理切片结果表明p YL272口服免疫组和p YL272序贯免疫组的炎性细胞减少、肺部出血情况减轻。攻毒后3d、5d、7d采集的口咽、泄殖腔拭子荧光定量PCR检测,结果发现BSG组排毒水平最高,p YL272序贯免疫组排毒水平较低。试验表明p YL272序贯免疫组能够增强机体的黏膜免疫,一定程度降低了雏鸡病毒感染症状。综上所述,本研究成功构建了Mosaic hA-Ferritin重组质粒,通过延迟裂解型沙门菌表达并以纯化蛋白滴鼻序贯免疫雏鸡,结果表明口服免疫及序贯免疫组均能明显增强雏鸡脾细胞增殖及抗原蛋白刺激条件下细胞因子水平,其中序贯免疫方式效果更佳;攻毒后序贯免疫方式与口服免疫组相比黏膜抗体

关键词： h9n2亚型禽流感 Mosaic hA蛋白纳米颗粒减毒沙门菌序贯免疫

共表达h9n2亚型禽流感Mosaic hA蛋白、M1蛋白的沙门菌免疫效应评价

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共表达H9N2亚型禽流感Mosaic HA蛋白、M1蛋白的沙门菌免疫效应评价

作者：赵晓函吉林农业大学

学位级别：硕士

禽流感(avian influenza,AI)是由流感病毒引起的一类具有高传染性的疾病。其中h9n2亚型禽流感极易继发感染。一般预防流感病毒都会把接种疫苗作为最有效的防治手段,然而目前商品化疫苗存在着依赖于鸡胚进行生产并偏向于诱导体液免疫等缺... 详细信息

禽流感(avian influenza,AI)是由流感病毒引起的一类具有高传染性的疾病。其中h9n2亚型禽流感极易继发感染。一般预防流感病毒都会把接种疫苗作为最有效的防治手段,然而目前商品化疫苗存在着依赖于鸡胚进行生产并偏向于诱导体液免疫等缺点,因此研究针对h9n2亚型禽流感病毒的新型疫苗具有重要的意义。主要内容及结果如下。1.微环DnA载体构建及表达验证本研究将全长的Mosaic hA蛋白以及M1蛋白通过P2A序列连接到本课题组前期构建的微环DnA(minicircle DnA,mc DnA)表达系统上,成功构建了包含双CMV启动子的微环质粒p YL221,后在p YL221质粒的基础上加入优化过的佐剂ch GM-CSF表达框,成功构建出微环质粒p YL233。并通过间接免疫荧光和Western-Blot(WB)验证Mosaic hA蛋白、M1蛋白以及佐剂ch GM-CSF的表达。2.以沙门菌为载体递送h9n2亚型禽流感mc DnA载体的免疫效力评价本研究选取21日龄蛋鸡作为试验动物,对雏鸡进行四次免疫,免疫剂量1×10CFU/羽。三免后一周ELISA结果表明,χ11218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组hA蛋白特异性s Ig A水平有提高的趋势;四免后一周ELISA结果表明,χ11218(p YL233)组hA蛋白、M1蛋白特异性Ig Y抗体水平明显升高。流式细胞术分析结果表明χ11218(p YL221)组和χ11218(p YL233)组与BSG组相比CD3CD4T细胞数极显著升高(P＜0.001);χ11218(p YL221)组和χ11218(p YL233)组与χ11218(p YA4545)空载体组相比CD3CD8T细胞数显著升高(P218(p YL233)组与BSG组相比显著增强脾脏中T淋巴细胞增殖能力(Pn-γ和IL-4 m RnA水平结果表明,hA蛋白体外刺激脾细胞时,χ11218(p YL221)组与BSG组相比显著提高IFn-γm RnA水平(P218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组与对照组相比有提高IL-4、IFn-γm RnA水平的趋势。四免后两周对雏鸡进行攻毒,ELISA结果显示,与对照组相比χ11218(p YL233)和χ11218(p YL221)组在单个蛋白特异性s Ig A抗体水平和Ig Y抗体水平方面有一定的升高趋势。使用MDCK细胞检测雏鸡肺部病毒滴度结果表明,与χ11218(p YA4545)空载体组相比,χ11218(p YL221)能极显著降低肺部病毒含量(P＜0.01)。此外,与对照组相比,χ11218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组在一定程度上减轻雏鸡肺部病变。3.重组沙门菌对h9n2亚型禽流感肠道菌群的影响通过16Sr DnA测序分析鸡盲肠内容物结果表明,对门、纲水平分析发现沙门菌χ11218(p YL221)和χ11218(p YL233)免疫后可以提高厚壁菌门的丰度,且p YL233组提高拟杆菌门的丰度效果要优于p YL221组。对物种丰度聚类分析发现沙门菌免疫后的肠道菌群中厚壁菌门仍为优势菌群。通过多样性分析发现沙门菌免疫后可以显著增加菌群的丰富度与多样性。本研究表明含有P双启动子共表达h9n2亚型禽流感Mosaic hA蛋白、M1蛋白的延迟裂解型重组沙门菌具有一定保护作用。值得指出,尽管ch GM-CSF佐剂在某些指标方面增强了机体特异性免疫反应,但整体而言在我们的重组菌中作为佐剂的效果未达到预期效果,未来将选择其他更高效的佐剂分子进行研究。

关键词： h9n2亚型禽流感 Mosaic hA蛋白 M1蛋白佐剂chGM-CSF 肠道菌群

h9n2亚型禽流感流行现状及其公共卫生意义

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H9N2亚型禽流感流行现状及其公共卫生意义

h9n2亚型禽流感流行现状及其公共卫生意义

第3届全国人畜共患病学术研讨会

作者：方绍庆尹伟力周慧许红岩烟台出入境检验检疫局湖北省畜牧局

禽流感(Avian Influenza,AI)是A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病(甘孟侯,2004)。该病被世界动物卫生组织(World Organization for Animal health,OIE)列为A类烈性传染病,在我国为一类动物疫病。1878年,Perroncito首次报道... 详细信息

禽流感(Avian Influenza,AI)是A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病(甘孟侯,2004)。该病被世界动物卫生组织(World Organization for Animal health,OIE)列为A类烈性传染病,在我国为一类动物疫病。1878年,Perroncito首次报道在意大利的鸡群中暴发了一种称为鸡瘟的严重疾病,直到1955年才证实鸡瘟病毒实际上就是A型禽流感病毒。现已证实禽流感病毒广泛分布于世界范围内的许多家禽和野禽,每一次的暴发都给养禽业造成巨大的经济损失,是目前危害世界及我国养禽业的最重要的疫病之一,并且具有重要的公共卫生学意义。自1966年h9n2亚型禽流感病毒首次从火鸡中检测到以来,该病毒在世界各地都有广泛传播。病毒主要对呼吸、神经、消化和生殖系统造成损害,常以呼吸道症状,产蛋率、受精率及孵化率下降为主要特征,从而引发严重的经济损失。近几年来,我国沿107和316国道有部分鸡场,鸡群先后出现呼吸道症状,普遍腹泻,产蛋下降,产软皮蛋,经初步诊断为感染了h9n2亚型禽流感。这已对发病流行地区养禽业形成了不良影响,并造成了一定程度的经济损失。这些禽源h9n2的流感病毒在禽体内持续传播和进化的同时,不断出现直接传播到人的趋势,提示其有可能成为下一次大流感的潜在病毒毒株,这对全人类的健康再次造成了很大的威胁。为此,通过对h9n2亚型禽流感在世界流行情况,病毒的存在、传播及其演化等内容的介绍,阐明h9n2亚型禽流感公共卫生意义,这有助于我们增强对h9n2亚型禽流感禽流感的认识,为全面合理防治流感提出更为合理缜密的措施与策略。

关键词： h9n2亚型禽流感流行病学公共卫生意义

来源： cnki会议评论

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H9N2亚型禽流感流行现状及其公共卫生意义

新城疫与h9n2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒的构建与鉴定

动物检疫学分会2010年学术年会

作者：方绍庆尹伟力周慧许红岩烟台出入境检验检疫局湖北省畜牧局

目前h9n2亚型禽流感病毒世界各地都有广泛传播,这些禽源h9n2的流感病毒在禽体内持续传播和进化的同时,不断出现直接传播到人的趋势,提示其有可能成为下一次大流感的潜在病毒毒株,这对全人类的健康再次造成了很大的威胁。为此,通过对h9n... 详细信息

目前h9n2亚型禽流感病毒世界各地都有广泛传播,这些禽源h9n2的流感病毒在禽体内持续传播和进化的同时,不断出现直接传播到人的趋势,提示其有可能成为下一次大流感的潜在病毒毒株,这对全人类的健康再次造成了很大的威胁。为此,通过对h9n2亚型禽流感流感在世界流行情况,病毒的存在、传播及其演化等内容的介绍,阐明h9n2亚型禽流感公共卫生意义,增强对h9n2亚型禽流感禽流感的认识。

关键词： h9n2亚型禽流感流行病学公共卫生意义

来源： cnki会议评论

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黑龙江畜牧兽医 2018年第17期 122-125页

作者：李红丽闫巍文王红宝郭雪丽张晋强王志宇王毅山西省农业科学院畜牧兽医研究所太原030032 华南农业大学动物科学学院广州510642

为了构建新城疫与h9n2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒（cVLP）,试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和h9n2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-hn及r BV-FhA,并以适当比例感染悬浮... 详细信息

为了构建新城疫与h9n2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒（cVLP）,试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和h9n2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-hn及r BV-FhA,并以适当比例感染悬浮昆虫Sf9细胞,经蔗糖密度梯度纯化后获得嵌合型病毒样颗粒,同时采用新城疫和h9亚型禽流感标准阳性血清对嵌合型病毒样颗粒进行血凝和血凝抑制试验。结果表明：嵌合型病毒样颗粒以新城疫病毒M蛋白作为颗粒骨架,插入了新城疫病毒hn蛋白和经F蛋白胞内域融合的禽流感病毒hA蛋白,在电镜下观察纯化的嵌合型病毒样颗粒具有完整的囊膜结构及纤突,该颗粒具有结合两种阳性血清的能力。说明试验成功构建了包含有新城疫病毒M蛋白、hn蛋白和h9亚型禽流感病毒hA蛋白的嵌合型病毒样颗粒,并且保留了良好的生物学活性。

关键词：基因Ⅶ型新城疫病毒 h9n2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒构建鉴定

山西省北部地区蛋鸡h9n2亚型禽流感免疫水平检测及流行毒株的分离鉴定

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山西省北部地区蛋鸡H9N2亚型禽流感免疫水平检测及流行毒株的分离...

作者：杨述远山西农业大学

学位级别：硕士

h9n2亚型禽流感病毒是目前危害山西省北部地区规模化蛋鸡养殖业最主要的病原体之一。为了调查本亚型禽流感在该地区的流行情况,本研究对2018～2019年该地区9个市(县)的众多规模化蛋鸡养殖场血清样本进行了抗体检测。对27例疑似病例进行... 详细信息

h9n2亚型禽流感病毒是目前危害山西省北部地区规模化蛋鸡养殖业最主要的病原体之一。为了调查本亚型禽流感在该地区的流行情况,本研究对2018～2019年该地区9个市(县)的众多规模化蛋鸡养殖场血清样本进行了抗体检测。对27例疑似病例进行了临床综合诊断、病毒分离培养、PCR检测、基因测序和遗传进化分析,进而揭示本病流行毒株在该地区的分子流行病学特点。本研究对来自该地区两年来不同日龄和不同季节的鸡群所采集的5122份血清样本进行了hI抗体水平的检测。检测结果显示:该地区h9n2亚型禽流感整体免疫情况普遍较好,抗体平均值处于8.48 Log 2～10.98 Log 2之间,表明鸡群抗感染能力相对较高。2019年抗体各项指标较2018年均有所提升。每年春冬两季抗体水平高于夏秋两季,其抗体均值差异至少可达到1 Log 2以上,优秀率也存在10%以上的差异。不同日龄段的鸡群抗体滴度均较为理想,并且随着日龄逐渐增加鸡群抗体指标和免疫水平呈现稳步上升的趋势。值得关注的是个别鸡群(60≤日龄≤120)抗体均值和优秀率偏低,可能存在一定程度的感染风险。同时,对27例疑似病例进行实验室检测后,检测出h9n2亚型禽流感阳性病料11份,检出率占所有被检疑似病例总数的40.74%;通过临床诊断与实验室诊断相结合的方法,充分证实了h9n2亚型禽流感病毒是引起雏鸡早期呼吸道疾病以及各日龄段鸡群出现“支气管栓塞”症状的主要病原体之一。本研究最终从11份阳性病料中成功分离出三株当地流行株,并将其分别命名为SXJB1、SXJB2、SXJB3。基因测序结果显示:分离株彼此间hA基因核苷酸序列同源性为96.4%～97.3%,氨基酸同源性为97.2%～97.7%,亲缘关系密切;分离株与12株参考株相比,其核苷酸同源性介于88.4%～98.0%之间;分离株与疫苗株F株和SS株核苷酸的同源性均低于90%,但与疫苗株WJ57株同源性却达到95.5%～96.2%,可见WJ57株是一株针对当前本地区h9n2亚型禽流感流行株较为理想的疫苗候选株。系统进化树分析结果显示:分离株均属于BJ/94-like欧亚大分支,与福建、江西、安徽、河北等地分离株亲缘关系较近。本研究为h9n2亚型禽流感今后的临床诊断和综合防控提供了可靠的参考依据。

关键词： h9n2亚型禽流感抗体检测 PCR检测流行病学进化分析

2023年江苏常州地区h9n2亚型禽流感病毒遗传演化与抗原性分析

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中国家禽 2024年

作者：李玉冬张海涛罗燕周勇董金泽陈洪壮束思成陈雪张双玉刘晓妹杨亚军李荣杰夏福芳蒲娟罗坚强中国农业大学动物医学院兽医公共卫生安全全国重点实验室农业农村部禽流感等家禽重大疾病防控重点实验室江苏立华牧业股份有限公司常州市动物疫病预防控制中心

试验旨在调查h9n2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月，在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展h9n2亚型AIV流行病学调查，试验采... 详细信息

试验旨在调查h9n2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在江苏省常州市的流行情况。2023年3—12月，在常州市所有辖区的交易平台、散养户、活禽市场、屠宰场等7种场所类型的147个采样场点开展h9n2亚型AIV流行病学调查，试验采集鸡、鸭、鹅、鸽等咽拭子、组织样品以及环境拭子共计1 970份，进行AIV分离及其流行病学特征分析，并对分离的h9n2亚型AIV进行遗传演化、关键氨基酸与糖基化位点和抗原性分析。结果显示：共鉴定出73株h9n2亚型AIV，平均分离率为3.70%;4月和5月分离率较高，分别为7.07%和8.00%；分离地点中活禽市场和交易平台的分离率最高；h9n2亚型AIV在鸡、鸭、鸽、野鸟粪便和环境中均有分离，在环境和鸡中的分离率最高，分别为6.90%和4.15%；分离的h9n2亚型AIV属于欧亚谱系9.1分支中Group 2群，与2021—2023年多个地区人感染h9n2亚型AIV亲缘关系较近；与参考株序列相比，h9n2亚型AIV分离株hA蛋白的130-loop、150-loop及190-helix存在明显氨基酸多态性，但没有发现新的糖基化位点；h9n2亚型AIV分离株均属于当前优势流行的抗原群，尚未发生明显抗原漂移。综上所述，江苏常州地区h9n2亚型AIV流行的热点场所是活禽市场和交易平台，提示环境消毒是控制病毒传播和污染的关键手段；h9n2亚型AIV可能在野生禽类中流行，须减少家禽与野禽接触；并且h9n2亚型AIV分离株hA蛋白受体结构域变异可能对人间感染造成持续威胁，值得关注。

关键词： h9n2亚型禽流感活禽市场遗传演化抗原性江苏

pSIP409-nP-M1-DCpep乳酸菌制剂抗h9n2亚型禽流感效果的检测

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pSIP409-NP-M1-DCpep乳酸菌制剂抗H9N2亚型禽流感效果的检测

作者：刘玉颖吉林农业大学

学位级别：硕士

禽流感病毒(AIV)在全世界范围内传播,对家禽和人类健康构成严重威胁。在许多国家,低致病性禽流感病毒如h9n2不仅能够引起雏鸡轻微呼吸道疾病及产蛋量下降,也是造成大量雏鸡养殖严重经济损失的重要原因之一。乳酸菌具有安全易培养的特点... 详细信息

禽流感病毒(AIV)在全世界范围内传播,对家禽和人类健康构成严重威胁。在许多国家,低致病性禽流感病毒如h9n2不仅能够引起雏鸡轻微呼吸道疾病及产蛋量下降,也是造成大量雏鸡养殖严重经济损失的重要原因之一。乳酸菌具有安全易培养的特点,是一种多功能型微生态制剂,作为外源表达载体极具潜力。禽流感病毒的M蛋白(matrix protein,M)与nP蛋白(nucleo-protein,nP)已被证明是有效的候选疫苗抗原,且在不同亚型禽流感病毒之间高度保守。树突状细胞诱导肽(DCpep)源于噬菌体的短肽,能显著增强免疫应答。本文旨在研究使用植物乳杆菌nC8递呈nP-M1-DCpep时,能否增强雏鸡模型免疫应答抗h9n2亚型禽流感病毒感染。为实现这一目的,以1×109 CFU/200μL剂量给20日龄雏鸡灌服乳酸菌制剂nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep,初免和加强免疫后,对雏鸡感染h9n2亚型禽流感病毒,评价乳酸菌制剂nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep抗h9n2亚型禽流感病毒免疫效果。主要研究内容及结果如下:(1)乳酸菌制剂抗h9n2亚型禽流感病毒效果研究雏鸡口服给予nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep,加强免疫后流式细胞术检测雏鸡脾脏CD和CDT细胞的活化情况,MTS比色法检测雏鸡脾脏淋巴细胞特异性增殖转化能力,并采用间接ELISA法检测加强免疫后雏鸡血清、气管灌洗液中特异性抗体Ig G及SIg A含量。感染h9n2亚型禽流感病毒后,检测雏鸡肺部与喉头病理损伤,监测雏鸡体重丢失情况。结果表明,口服nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep能显著诱导雏鸡脾脏强烈的CD和CDT细胞的活化并增强淋巴细胞增殖转化能力。此外,乳酸菌制剂还能特异性增强雏鸡血清中Ig G抗体滴度及气管灌洗液中SIg A分泌水平。感染h9n2亚型禽流感病毒后,与其它对照组相比,口服乳酸菌制剂nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep能显著降低雏鸡肺部及喉头病理损伤程度并且减少雏鸡体重丢失。(2)乳酸菌制剂给药途径的筛选虽然,口服乳酸菌制剂在预防流感病毒感染方面有效果,但由于胃肠道酸性环境及肠上皮细胞或抗原呈递细胞的吸收程度等原因,口服给药及免疫的进展一直相当缓慢。而滴鼻免疫植物乳杆菌由于直接增强呼吸免疫系统在保护抗呼吸道感染方面效果明显[1]。因此,本研究通过滴鼻与口服两种途径免疫乳酸菌制剂,并对雏鸡感染h9n2亚型禽流感病毒,进一步对两种乳酸菌给药途径抗h9n2亚型禽流感病毒效果进行比较。乳酸菌制剂给药途径筛选结果表明,滴鼻免疫nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep较口服途径能更显著增强气管粘膜SIg A分泌水平,呼吸道粘膜SIg A抗体对抗不同呼吸道病毒感染提供交叉保护作用,与系统性Ig G抗体相比在提高局部免疫应答可能具有更高的抗病毒效果。其中,滴鼻免疫nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep的雏鸡体重丢失率、肺部及气管病理损伤程度要低于口服免疫nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep。滴鼻免疫nC8-p SIP409-nP-M1-DCpep能够更显著的诱导雏鸡特异性抗h9n2 AIV感染保护性免疫反应。

关键词： h9n2亚型禽流感乳酸菌 M蛋白 nP蛋白 DCpep