共表达H9N2亚型禽流感Mosaic HA蛋白、M1蛋白的沙门菌免疫效应评价

作     者：赵晓函 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜延龙

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：H9N2亚型禽流感 Mosaic HA蛋白 M1蛋白 佐剂chGM-CSF 肠道菌群 

摘      要：禽流感(avian influenza,AI)是由流感病毒引起的一类具有高传染性的疾病。其中H9N2亚型禽流感极易继发感染。一般预防流感病毒都会把接种疫苗作为最有效的防治手段,然而目前商品化疫苗存在着依赖于鸡胚进行生产并偏向于诱导体液免疫等缺点,因此研究针对H9N2亚型禽流感病毒的新型疫苗具有重要的意义。主要内容及结果如下。1.微环DNA载体构建及表达验证本研究将全长的Mosaic HA蛋白以及M1蛋白通过P2A序列连接到本课题组前期构建的微环DNA(minicircle DNA,mc DNA)表达系统上,成功构建了包含双CMV启动子的微环质粒p YL221,后在p YL221质粒的基础上加入优化过的佐剂ch GM-CSF表达框,成功构建出微环质粒p YL233。并通过间接免疫荧光和Western-Blot(WB)验证Mosaic HA蛋白、M1蛋白以及佐剂ch GM-CSF的表达。2.以沙门菌为载体递送H9N2亚型禽流感mc DNA载体的免疫效力评价本研究选取21日龄蛋鸡作为试验动物,对雏鸡进行四次免疫,免疫剂量1×10CFU/羽。三免后一周ELISA结果表明,χ11218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组HA蛋白特异性s Ig A水平有提高的趋势;四免后一周ELISA结果表明,χ11218(p YL233)组HA蛋白、M1蛋白特异性Ig Y抗体水平明显升高。流式细胞术分析结果表明χ11218(p YL221)组和χ11218(p YL233)组与BSG组相比CD3CD4T细胞数极显著升高(P0.001);χ11218(p YL221)组和χ11218(p YL233)组与χ11218(p YA4545)空载体组相比CD3CD8T细胞数显著升高(P0.05)。淋巴细胞增殖试验结果表明χ11218(p YL233)组与BSG组相比显著增强脾脏中T淋巴细胞增殖能力(P0.05)。荧光定量PCR法检测脾细胞中细胞因子IFN-γ和IL-4 m RNA水平结果表明,HA蛋白体外刺激脾细胞时,χ11218(p YL221)组与BSG组相比显著提高IFN-γm RNA水平(P0.05),M1蛋白体外刺激脾细胞,χ11218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组与对照组相比有提高IL-4、IFN-γm RNA水平的趋势。四免后两周对雏鸡进行攻毒,ELISA结果显示,与对照组相比χ11218(p YL233)和χ11218(p YL221)组在单个蛋白特异性s Ig A抗体水平和Ig Y抗体水平方面有一定的升高趋势。使用MDCK细胞检测雏鸡肺部病毒滴度结果表明,与χ11218(p YA4545)空载体组相比,χ11218(p YL221)能极显著降低肺部病毒含量(P0.01)。此外,与对照组相比,χ11218(p YL221)组、χ11218(p YL233)组在一定程度上减轻雏鸡肺部病变。3.重组沙门菌对H9N2亚型禽流感肠道菌群的影响通过16Sr DNA测序分析鸡盲肠内容物结果表明,对门、纲水平分析发现沙门菌χ11218(p YL221)和χ11218(p YL233)免疫后可以提高厚壁菌门的丰度,且p YL233组提高拟杆菌门的丰度效果要优于p YL221组。对物种丰度聚类分析发现沙门菌免疫后的肠道菌群中厚壁菌门仍为优势菌群。通过多样性分析发现沙门菌免疫后可以显著增加菌群的丰富度与多样性。本研究表明含有P双启动子共表达H9N2亚型禽流感Mosaic HA蛋白、M1蛋白的延迟裂解型重组沙门菌具有一定保护作用。值得指出,尽管ch GM-CSF佐剂在某些指标方面增强了机体特异性免疫反应,但整体而言在我们的重组菌中作为佐剂的效果未达到预期效果,未来将选择其他更高效的佐剂分子进行研究。