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四川大学学报（医学版） 2009年第5期40卷 770-774页

作者：葛亚俊谢晓砚杨博柴新娟张迎春覃扬四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室成都610041

目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因h19和胰岛素样生长因子2(igf2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞hepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检... 详细信息

目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白基因(VIGILIN)是否参与肝癌细胞在细胞周期中印记基因h19和胰岛素样生长因子2(igf2)表达的调控。方法通过流式细胞术检测人肝癌细胞hepG2细胞周期选择周期点,采用RT-PCR、RNA干扰、实时荧光定量RT-PCR检测各周期点VIGILIN、h19、igf2基因表达。结果①hepG2细胞周期约为20h;其中0～9h、20～28h约为S期,9～20h、28～39h约为G2/M、G1期,并选定6h、20h、43h、60h,分别代表S期中期、G1～S期、S期中期和G1期末;②细胞周期同步化后加入血清,刺激VIGILIN转录,上调VIGILIN的表达,从G2/M至G1期,逐渐增加,G1期末达高峰,S期逐渐减少;与之相反,h19的表达,在S期逐渐增加,在G2/MG1期逐渐减少,在S期中期达到高峰。而igf2的表达也增加但没有明显的周期性。h19与VIGILIN mRNA表达呈负相关(r=-0.6941,PhRNA(pSIREN-VIG shRNA)重组载体转染hepG2细胞48h后,相对于3个对照组(未转染组,脂质体转染组和转染pSIREN-GFP shRNA组),实验组VIGILIN mRNA的表达受到明显抑制,此时,igf2mRNA表达增加30.13%,h19mRNA表达减少12.08%。结论VIGILIN和h19 mRNA表达与细胞周期有关;VIGILIN参与调控h19、igf2印记基因的表达。

关键词：高密度脂蛋白结合蛋白 h19/igf2 mRNA表达细胞周期细胞增殖

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体外受精-胚胎移植通过影响DNMT3B表达水平影响小鼠妊娠中晚期胎盘生长动力学轨迹

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现代妇产科进展 2021年第9期30卷 656-661页

作者：相萌陈书强西安医学院临床医学院妇产科教研室西安710021 空军军医大学第二附属医院妇产科生殖中心西安710038

目的:从分子信号通路水平更多地揭示体外受精(IVF)致胎盘生长动力轨迹改变的机制,为促进和改善IVF的体外操作提供理论支持和预警靶点,降低子代远期代谢疾病的发病风险。方法:构建IVF小鼠模型,比较IVF组与自然妊娠组(NC组)小鼠胎盘在妊娠... 详细信息

目的:从分子信号通路水平更多地揭示体外受精(IVF)致胎盘生长动力轨迹改变的机制,为促进和改善IVF的体外操作提供理论支持和预警靶点,降低子代远期代谢疾病的发病风险。方法:构建IVF小鼠模型,比较IVF组与自然妊娠组(NC组)小鼠胎盘在妊娠12.5、14.5、16.5天与18.5天的胎盘质量与胎盘效率,绘制IVF小鼠胎盘与NC组小鼠胎盘妊娠中晚期胎盘质量与胎盘效率曲线。Q-RT-PCR检测两组胎盘在妊娠中晚期不同时间h19及其衍生的miR-675表达水平,igfs及其受体表达水平。Western blot法检测两组胎盘在妊娠中晚期不同时间甲基化酶类蛋白水平。Chip-q-PCR检测两组胎盘在妊娠12.5天及18.5天DNMT3B与h19ICR区的结合丰度。结果:IVF组小鼠胎盘质量在妊娠12.5天显著低于NC组,胎盘效率显著低于NC组,而在妊娠16.5天及18.5天胎盘质量显著高于NC组,胎盘效率显著低于NC组,差异有统计学意义(Ph19及其衍生的miR-675在妊娠12.5天显著高于NC组,而在妊娠16.5天及18.5天显著低于NC组,差异有统计学意义(Pigfs及其受体mRNA相对表达量在妊娠12.5天显著低于NC组,而在妊娠16.5天及18.5天显著高于NC组,差异有统计学意义(Ph19ICR区的结合丰度显著低于NC组,而在妊娠18.5天胎盘甲基化酶DNMT3B及其与h19ICR区的结合丰度显著高于NC组,差异有统计学意义(Ph19及其衍生的miR-657激活了igfs及其下游信号通路,致小鼠妊娠末期胎盘生长曲线偏离。IVF通过调节DNMT3B表达水平及其与h19ICR区的结合水平引起小鼠妊娠中晚期胎盘生长动力学轨迹改变。

关键词： IVF h19/igf2 Dnmt3b ART 过甲基化 igfs 表观调节

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h19基因印记调控区DNA甲基化对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎的作用研究

H19基因印记调控区DNA甲基化对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎的作...

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作者：褚乐伟内蒙古大学

学位级别：硕士

哺乳动物孤雌胚胎无法正常发育至出生与印记基因异常表达相关,DNA甲基化在其中发挥重要作用。本研究首先分离培养小鼠孤雌胚胎干细胞系,检测印记基因表达及DNA甲基化;其次利用CRISPR-d Cas9技术构建载体,靶向修饰印记基因h19印记调控区... 详细信息

哺乳动物孤雌胚胎无法正常发育至出生与印记基因异常表达相关,DNA甲基化在其中发挥重要作用。本研究首先分离培养小鼠孤雌胚胎干细胞系,检测印记基因表达及DNA甲基化;其次利用CRISPR-d Cas9技术构建载体,靶向修饰印记基因h19印记调控区DNA甲基化,研究DNA甲基化对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎的影响。1.小鼠孤雌胚胎干细胞(PESCs)的建系及鉴定将SrCl激活的囊胚期孤雌胚胎置于N2B27培养液中培养,传代后获得孤雌胚胎干细胞系PESCs。检测表明,所获得的PESCs形态与正常小鼠胚胎干细胞(ESCs)相似,81%的细胞具有正常染色体数目(2n=40);在体外可形成具有三个胚层分化的拟胚体,但在体内未形成畸胎瘤。与ESCs相比,PESCs母系印记基因igf2表达较低,Snrpn启动子区呈高甲基化状态;父系印记基因h19表达较高,h19启动子区呈低甲基化状态。2.h19基因印记调控区DNA甲基化修饰的作用研究研究表明印记调控区DNA甲基化影响h19/igf2表达水平,本研究检测表明,该区域4个CTCF结合位点中CTCF4结合位点DNA甲基化在PESCs明显低于ESCs。为探究PESCs中h19基因印记调控区DNA甲基化修饰对igf2表达的调节,构建了CRISPR/d Cas9-Dnmt3a载体,并针对CTCF4结合位点设计CTCF4-sg RNA;经Bam hI和Xho I双酶切,连接CTCF4-sg RNA至空载体pg RNA-humanized,测序验证sg RNA-humanized载体构建成功。利用慢病毒转染法将载体CRISPR/d Cas9-Dnmt3a与sg RNA-humanized共转染PESCs后,发现CTCF4结合位点DNA甲基化明显增加,igf2 m RNA表达升高,h19 m RNA表达减少。Ch IP检测表明,转染后CTCF蛋白与h19印记调控区结合减少,而CTCF表达在转染前后无明显差异。为研究h19印记调控区DNA甲基化修饰对胚胎发育的影响,对激活后的孤雌胚胎显微注射靶向修饰载体,移植后解剖观察到畸形胚胎,暂未获得正常出生个体。综上所述,CRISPR/dCas9-Dnmt3a介导的方法可以对h19/igf2基因座CTCF结合位点进行DNA甲基化修饰,通过调节基因表达对小鼠孤雌胚胎干细胞和孤雌胚胎发育产生影响。本研究为阐明印记基因簇h19/igf2的调控及深入研究孤雌胚胎发育机制提供了研究基础。

关键词： h19/igf2 印记调控区 DNA甲基化孤雌胚胎干细胞孤雌胚胎

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卵裂球丢失对冻融胚胎移植结局的影响及子代脐血淋巴细胞的转录组分析

卵裂球丢失对冻融胚胎移植结局的影响及子代脐血淋巴细胞的转录组...

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作者：吴琰浙江大学

学位级别：硕士

冻融胚胎移植(Frozen-thawed embryo transfer, FET)已成为辅助生殖技术(Assisted reproductive technology, ART)的一个重要组成部分。伴随而来的卵裂球丢失问题也日益受到关注,之前的研究对卵裂球丢失是否会对胚胎的发育产生影响存在... 详细信息

冻融胚胎移植(Frozen-thawed embryo transfer, FET)已成为辅助生殖技术(Assisted reproductive technology, ART)的一个重要组成部分。伴随而来的卵裂球丢失问题也日益受到关注,之前的研究对卵裂球丢失是否会对胚胎的发育产生影响存在着争议。关于子代围生期结局,先前的研究多见于冻融胚胎和新鲜胚胎移植的比较,而针对卵裂球丢失的研究甚少。近年来新兴的转录组测序技术RNA-Seq可有助于我们获得大量关于FET出生子代的遗传信息,从而揭示相关分子机理。本研究通过大样本的临床资料分析和转录组学研究,旨在评价卵裂球丢失对冻融胚胎移植结局及子代围生期结局的影响,为FET的临床合理应用提供依据。第一部分卵裂球丢失对冻融胚胎移植结局影响及子代围生期结局比较目的：研究冻融胚胎过程中卵裂球的丢失是否会对胚胎的种植和发育以及子代围生期结局产生影响。方法：回顾性分析了2005年1月至2012年12月在四大生殖中心进行的5573例FET周期,所有移植的胚胎均丢失至少一个卵裂球的周期纳入丢失组(N=1860),所有移植的胚胎卵裂球均完整的周期纳入完整组(N=3713),比较分析了两组间的种植率、妊娠率和活产率等相关移植结局。同时对其中所有的丢失组单胎子代(N=269)、完整组单胎子代(N=687)和其他自然妊娠的单胎子代(N=1762)的围生期结局进行了比较和分析。结果：在冻融胚胎移植结局的比较上,丢失组在种植率、化学妊娠率、临床妊娠率和活产率等方面均显著低于完整组,但两组的异位妊娠率和流产率无显著性差异。关于单胎活产子代的围生期结局,早产率、剖宫产率和大于胎龄儿(Large for gestational age, LGA)的发生率在丢失组和完整组均显著高于自然妊娠组,而小于胎龄儿(Small for gestational age, SGA)的发生率则在丢失组中明显高于完整组和自然妊娠组。结论：胚胎冻融过程中卵裂球的丢失会降低胚胎的发育潜能,且会增加小于胎龄儿发生的风险。同时冻融胚胎会导致大于胎龄儿发生的风险增加,其机理尚待进一步研究。第二部分卵裂球丢失和完整的冻融胚胎与自然妊娠子代的转录组学研究目的：采用RNA-Seq的方法进一步研究冻融胚胎及卵裂球丢失对子代脐血淋巴细胞转录组的改变,从转录组水平分析差异表达基因对子代造成的影响。方法：研究对象为在本院行FET后于2012年6月至2013年5月分娩的单胎子代,其中由卵裂球丢失胚胎发育而来的纳入丢失组,由卵裂球完整胚胎发育而来的纳入完整组,同时随机选取符合条件的自然妊娠单胎子代纳入自然妊娠组。收集脐带血并提取淋巴细胞后,对每组各5例进行了转录组测序,并对有显著表达差异的基因(Differentially expressed gene, DEG)进行了功能分析。结果：从脐带血淋巴细胞中我们一共检测到9427个转录本,丢失组和自然妊娠组之间有92个DEGs,完整组和自然妊娠组之间只有2个DEGs,这些基因大部分与细胞的生长发育有关。丢失组和完整组之间有132个DEGs,但FDR均大于0.05,从统计学意义上认为基因差异表达的水平不显著。结论：脐带血淋巴细胞的转录组测序提供了一种新的视角去分析和研究冻融胚胎及卵裂球丢失的分子机制,其中包括胰岛素样生长因子系统的改变,而h19和igf2这一对印记基因表达的改变更值得进一步的研究。

关键词：冻融胚胎移植卵裂球丢失妊娠率围生期结局转录组测序 h19/igf2

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