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用荧光定量RT-PCR方法检测新型鸭呼肠孤病毒

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浙江农业学报 2015年第8期27卷 1331-1336页

作者：韩宏宇马秀丽黄兵李建亮张玉瑶于可响崔言顺山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 山东省农业科学院家禽研究所禽病研究中心山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室山东济南250023

根据新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）S1基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR greenⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据含目的基因的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。敏感性试验显示,该方法最低... 详细信息

根据新型鸭呼肠孤病毒（novel duck reovirus,NDRV）S1基因序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR greenⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据含目的基因的质粒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。敏感性试验显示,该方法最低可检出15个拷贝的病毒c DNA,其病毒最低检出量为0.5TCID50。该方法具有良好的特异性,对鸭坦布苏病毒（DTMUV）、A型鸭甲肝病毒（DHV-1）、C型鸭甲肝病毒（DHV-3）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、减蛋综合征病毒（EDSV）、鸭新城疫病毒（NDV）、鸭瘟病毒（DPV）、鸭疫里默氏杆菌（RA）的检测结果均为阴性。该方法重复性好,组内变异系数为0.32%~0.91%,组间变异系数为1.03%~1.51%。利用该方法对人工感染雏鸭的粪便排毒情况进行检测,结果发现,攻毒后2~12 d是粪便排毒期,其中3~6 d是排毒高峰期。临床样品检测结果表明,该方法比常规RT-PCR具有更高的敏感性,而且从收到样品到得出检测结果只需4 h。

关键词：新型鸭呼肠孤病毒 SYBR greenⅰ 实时荧光定量RT-PCR

美国白蛾核型多角体病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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昆虫学报 2010年第7期53卷 824-830页

作者：乔鲁芹曲良建王玉珠张永安杨忠岐陶万强关玲山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所北京100091 北京市林业保护站北京100029

为了建立对昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒... 详细信息

为了建立对昆虫核型多角体病毒(nucleopolyhedrovirus)进行定量检测方法,本研究选用美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒的polyhedrin基因为目的基因,经引物设计、PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品DNA进行检测,构建出美国白蛾核型多角体病毒SYBR greenⅰ荧光定量标准曲线。统计学分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R=0.998)。该方法的检测灵敏度为101～102拷贝/μL,线性范围达5个数量级,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间的变异系数均小于3%。根据已建立的方法对不同感染时间段的感病幼虫进行检测,每毫克幼虫样本内病毒polyhedrin基因拷贝数增殖倍数对数值与感染时间(d)呈正相关(R=0.987)。这些结果表明,建立的美国白蛾核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法是可靠的,具有灵敏度高、重复性好等特点,可为昆虫核型多角体病毒体内增殖动态研究及昆虫病毒的标准化生产提供参考。

关键词：美国白蛾核型多角体病毒 SYBR greenⅰ 荧光定量PCR 感病幼虫检测

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2015年第6期45卷 644-648页

作者：张雪杨倩于红欣王俊孟凡伟周双海北京农学院动物科学技术学院北京102206 北京市怀柔区动物疫病预防控制中心北京101400

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR greenⅰ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显... 详细信息

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR greenⅰ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 SYBR greenⅰ 荧光定量PCR 早期快速诊断

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

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华北农学报 2014年第2期29卷 66-70页

作者：李鹏郭军庆金前跃李青梅李清州万博王选年王川庆张改平河南省农业科学院农业部动物免疫学重点实验室河南省动物免疫学重点实验室河南郑州450002 新乡学院生命科学与技术系生物技术研究中心河南新乡453003 河南省农业科学院农业经济与信息研究所河南郑州450002 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR greenⅰReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10-100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）以及猪细... 详细信息

根据PCV2 ORF1设计1对特异性引物,建立了SYBR greenⅰReal-time PCR检测方法。该方法灵敏度可达10-100拷贝/μL,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）以及猪细小病毒（PPV）没有交叉反应,利用该方法从50份临床病料中检测出43份阳性PCV2病毒,阳性检出率为94%。与常规PCR比较结果显示,该方法具有较高的灵敏度和特异性,能够快速检测和监控PCV2的感染流行。

关键词：猪圆环病毒2型 SYBR greenⅰ 荧光定量PCR

一种基于ELISA检测氮芥诱导的MGMT-DNA交联体的方法

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第三军医大学学报 2016年第18期38卷 1997-2001页

作者：阳慧琼程晋丁娇艳叶枫邹仲敏第三军医大学军事预防医学院毒理学研究所重庆400038

目的建立一种基于酶联免疫吸附法检测O6-烷基转移酶(O6-Methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)与DNA的交联体(MGMT-DNA crosslink,M-DPC)含量的简便方法。方法整合当前技术提取及纯化M-DPC、定量M-DPC样品中ds DNA含量、优化DPC中抗原在ELISA板的包被能力等关键环节。以不同浓度氮芥处理人支气管上皮细胞HBE,在指定的时间收集细胞,使用细胞核抽提/裂解/Tris饱和酚回收法制备M-DPC样品。采用SYBR greenⅰ染色方法对M-DPC样品中ds DNA进行定量。采用全能核酸酶对M-DPC样品中脱氧核糖核酸降解,以增强M-DPC样品中抗原在ELISA板的包被能力。最终,包被后的多孔板检测采用常规的ELISA。结果无需高速离心机和放射性同位素等,使用常规方法提取了细胞M-DPC。SYBR greenⅰ检测基因组ds DNA的线性范围为2 ng至1.5μg,可以用于提取的M-DPC所含ds DNA的定量,据此统一样本用量。M-DPC可以通过ELISA检出,且在一定范围内有线性关系。氮芥染毒3 h后M-DPC含量有显著增加,且对氮芥剂量有依赖。至24 h M-DPC含量无显著降低。结论所建立的ELISA检测M-DPC的方法快速、经济、灵敏、高通量,也可应用于部分其他交联蛋白的检测。氮芥染毒所致M-DPC形成有时间和剂量效应。

关键词： MGMT-DNA交联物 ELISA SYBR greenⅰ 氮芥

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

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食品科学 2011年第12期32卷 278-282页

作者：胡慧陈雅君段志刚孟振北彭新然张龙现崔保安王亚宾河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 漯河出入境检验检疫局河南漯河450046

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR greenⅰ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重... 详细信息

为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chainreaction,RT-PCR)方法,针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE设计一对特异引物,建立SYBR greenⅰ实时定量PCR检测方法,并进行灵敏度、重复性和特异性实验,同时与常规PCR方法进行比较。结果显示所建立的SYBRgreenⅰ实时定量PCR方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7,细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL,临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。与常规PCR方法相比,SYBR greenⅰ实时定量PCR方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。本研究建立的SYBR greenⅰ荧光定量PCR技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

关键词：大肠杆菌O157:H7 rfbE基因 SYBR greenⅰ 实时PCR

小反刍兽疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

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华北农学报 2018年第A1期33卷 84-88页

作者：李林杰刘萍马鹏王悦萦郭富城马晓霞周建华柏家林西北民族大学生物医学研究中心甘肃兰州730030 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR greenⅰ实时荧光定... 详细信息

为了建立一种快速检测小反刍兽疫病毒的方法。根据Gen Bank中公布的PPRV Nigeria75/1株H基因序列设计2对引物,PCR扩增出1 830 bpH基因,构建标准质粒p MD-18-H。以标准质粒优化反应条件,建立了小反刍兽疫病毒H基因SYBR greenⅰ实时荧光定量PCR检测方法。最优反应体系25μL:2×SYBR qPCR Mix 12. 5μL,模板DNA 1μL,特异引物各0. 2μL(0. 2μmol/L),DEPC H2O 10. 5μL;最佳反应条件:94℃2 min; 94℃5 s,57℃30 s,40个循环,Ct值与标准质粒模板浓度在3. 28×104～3. 28×10-2copies/μL 7个浓度梯度呈良好线性关系y=-2. 913x+36. 904,斜率为-2. 913,扩增效率120. 5%,相关系数R2=0. 994。建立的实时荧光定量PCR检测方法比普通PCR灵敏度高10 000倍,稳定性好,特异性强,对PPRV的准确诊断和定量检测具有重要意义。

关键词：小反刍兽疫病毒(PPRV) SYBR greenⅰ 实时荧光定量PCR

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

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中国畜牧兽医 2016年第10期43卷 2534-2540页

作者：赵孟孟冯松林王文佳邢星冯嘉萍张桂红华南农业大学兽医学院国家生猪种业工程技术研究中心广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广州510642 河南农业大学牧医工程学院郑州450002 河南牧业经济学院制药工程学院郑州450046 广西钦州保税港区出入境检验检疫局钦州535008

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR green... 详细信息

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSV Nsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR greenⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×104~1×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 SYBR greenⅰ 实时荧光定量PCR Nsp9基因

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禽肺炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2014年第10期35卷 1-6页

作者：谢志勤谢芝勋刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴罗思思广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了一对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物,应用该引物建立了SYBR greenⅰ实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行特异性、敏感性测定和临床样品检验。经检验该方法能特异性... 详细信息

根据C亚型禽肺炎病毒F基因序列,设计了一对针对C亚型禽肺炎病毒的特异性引物,应用该引物建立了SYBR greenⅰ实时荧光定量RT-PCR检测C亚型禽肺炎病毒的方法,并对建立的方法进行特异性、敏感性测定和临床样品检验。经检验该方法能特异性地鉴别检测禽肺炎病毒,特异性好;敏感性可检测到10个拷贝的禽肺炎病毒质粒DNA模板;对收集的54份鸡肺病料样品进行检测,没有检测到C亚型禽肺炎病毒阳性病料。建立的SYBR greenⅰ实时荧光定量RT-PCR方法检测C亚型禽肺炎病毒具有特异、敏感、快速、定量等优点,用该方法检测证实,采集的临床样品中还没有C亚型禽肺炎病毒的存在。

关键词： SYBR greenⅰ 实时荧光定量RT-PCR 检测禽肺炎病毒