检索结果-南通市图书馆

作者：王炳卫南方医科大学

学位级别：硕士

[课题背景] 前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国家男性恶性肿瘤的第1位和死亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国家,但随着生活方式改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛应... 详细信息

[课题背景] 前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,其发病率为欧美国家男性恶性肿瘤的第1位和死亡率第2位。我国PCa的发病率虽低于欧美国家,但随着生活方式改变、人口老龄化及前列腺特异性抗原(PSA)广泛应用于筛查,近年来,PCa的发病率呈明显上升趋势。国内一项PSA筛查研究发现,50岁以上男性的前列腺癌发病率为0.78%,提示中国的前列腺癌实际发病率并不低。因此,寻找前列腺癌有效治疗方法已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤,在肿瘤细胞中,复杂糖链的结构发生异常改变,且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶v (N-acetylglucosaminyltransferase v,gnt-v)是一个与肿瘤及肿瘤转移相关的酶,研究表明gnt-v在很多恶性肿瘤中增多,其产物GIcNAcβ1,6Manαl,6结构有利于外链的延伸,已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。基因治疗是一种有前景的肿瘤治疗手段,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来迅速发展起来的一项新的基因功能研究手段,它是利用与靶基因同源的小片段双链RNA(dsRNA),即：siRNA,转染靶细胞,促进靶基因mRNA降解,从而特异性诱导转录后基因沉默。将siRNA所对应的模板DNA双链序列克隆入质粒转染细胞,DNA模板在细胞内转录成小片段发夹状]RNA (shRNA),与化学合成的小干扰RNA (siRNA)具有相同的基因封闭作用,但作用时间可长达2个月,因其特异性和高效性成为当前肿瘤基因治疗的热点。本实验利用RNAi原理和技术,针对前列腺癌中高表达基因gnt-v的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人前列腺癌PC-3细胞,观察RNAi对gnt-v基因表达的抑制效应,寻找抑制效率较高的RNAi片段,为寻找有效治疗前列腺癌分子靶向研究中新靶点提供实验依据。 [实验方法] 1、pGPU6/GFP/Neo gnt-v shRNA质粒的构建及鉴定 (1) gnt-v siRNA序列的设计：根据NCBI数据库中gnt-v基因已知序列(NM02410.3)和siRNA设计原则,设计针对gnt-vcDNA的RNA片段,其序列为：gnt-v/1079 sense’GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3’;经Blast检索确认与gnt-v以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对的序列打乱排列,通过Blast分析无同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列为：gnt-v/NC sense5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’。由上海吉玛公司采用化学合成方法合成上述siRNA。 (2)shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。 (3)质粒pGPU6/GFP/Neo gnt-v的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。 2、细胞培养与转染人前列腺癌细胞株PC-3在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,37℃、5%CO2湿度下培养,每周传代2～3次。PC-3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC-3细胞。 3、干扰效果检测 (1)半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测gnt-v mRNA表达转染成功后,继续培养PC-3细胞48h后,收集细胞,经Trizo1一步法提取总RNA,采用AMv逆转录合成cDNA,进行PCR反应。gnt-v上游引物为5’AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC3’,下游引物为5’TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3’,产物长度为555bp。PCR反应条件：94℃预变性5min,94℃变性30s,40℃退火30s,72℃延伸30s,共30个循环;最后72℃再延伸10min.以β-actin为内参,上游引物为5’GAMCTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3’,产物长度为219 bp。以扩增产物3μl在2%琼脂糖凝胶中

关键词： gnt-v RNAi 前列腺癌侵袭能力实验研究

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gnt-v通过影响自噬调控糖尿病小鼠的心肌损伤

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山西医科大学学报 2024年第7期55卷 842-848页

作者：赵然王婷婷赵杰琼李妍空军军医大学第二附属医院心血管内科西安710068

目的探究N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(N-acetylglucosaminetransferase-v,gnt-v)对糖尿病心肌病小鼠心肌损伤的影响及潜在分子机制。方法30只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组(Con组)、糖尿病心肌病组(DCM组)和糖尿病心肌病+干扰gnt-... 详细信息

目的探究N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(N-acetylglucosaminetransferase-v,gnt-v)对糖尿病心肌病小鼠心肌损伤的影响及潜在分子机制。方法30只6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,随机分为对照组(Con组)、糖尿病心肌病组(DCM组)和糖尿病心肌病+干扰gnt-v基因的腺相关病毒组(DCM+AAv-shgnt-v组),每组10只。DCM组小鼠腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素,连续5 d,诱导糖尿病模型(随机血糖≥16.7 mmol/L),继续普通饮食喂养12周诱导糖尿病心肌病模型;对照组小鼠腹腔注射相应剂量的的柠檬酸盐缓冲液;DCM+AAv-shgnt-v组在糖尿病模型诱导成功后4周,通过心肌注射40μL滴度为1×10^(10)PFU/mL的腺相关病毒(AAv)-shgnt-v以敲低gnt-v基因。超声心动图检测各组小鼠心脏功能,Masson染色观察各组小鼠心肌纤维化情况,TUNEL染色检测各组小鼠心肌细胞凋亡程度,免疫组化染色观察各组心肌组织中gnt-v和Beclin1的表达情况,Western blot法检测自噬蛋白LC3、P62及PI3K/AKT通路的蛋白表达情况。结果与Con组相比,DCM组小鼠心脏收缩功能显著降低(Pgnt-v、自噬蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著增加,P62的表达明显减少(Pv-shgnt-v组小鼠心脏收缩功能明显改善(Pgnt-v、Beclin1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著下调,P62的表达明显增加(Pgnt-v基因可以显著改善糖尿病心肌病小鼠的心肌组织纤维化进展和心肌细胞凋亡程度,其作用可能与激活PI3K/AKT信号通路,进而抑制心肌自噬有关。

关键词：糖尿病心肌病自噬凋亡心肌纤维化 gnt-v PI3K/AKT

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抑制糖基转移酶gnt-v的表达可增强胶质瘤细胞放射敏感性

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湖北医药学院学报 2017年第6期36卷 487-490,F0002页

作者：宫梦晓沈力刘艳芹柯青骆志国唐以军十堰市太和医院.湖北医药学院附属医院肿瘤防治中心锦州医科大学十堰市太和医院研究生培养基地湖北医药学院基础医学院生物化学教研室十堰市太和医院.湖北医药学院附属医院呼吸内科湖北十堰442000

目的:探讨N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(gnt-v)介导的N-糖基化修饰在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用及调控机制。方法:采用RT-PCR和Western blot技术筛选gnt-v高表达的胶质瘤细胞;运用RNA干扰技术抑制gnt-v基因和蛋白表达,流式细胞术和荧光... 详细信息

目的:探讨N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(gnt-v)介导的N-糖基化修饰在胶质瘤细胞放射敏感性中的作用及调控机制。方法:采用RT-PCR和Western blot技术筛选gnt-v高表达的胶质瘤细胞;运用RNA干扰技术抑制gnt-v基因和蛋白表达,流式细胞术和荧光显微镜观察细胞N-糖基化修饰改变;4 Gy X-射线处理后分析细胞放射敏感性差异。结果:成功筛选gnt-v高表达的U251细胞;下调U251细胞中gnt-v的表达,可阻断N-糖链合成,逆转X-射线诱导的G2/M期阻滞,促进细胞凋亡。结论:抑制gnt-v的表达可通过阻断N-糖基化修饰增强胶质瘤细胞的放射敏感性。

关键词： gnt-v N-糖基化胶质瘤放射敏感性

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胃癌细胞株中gnt-v表达水平的检测

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世界肿瘤杂志 2010年第2期9卷 92-94,110页

作者：吴琼操龙阳张俊杰张丽欧宏亮孙龙娥王志荣同济大学附属同济医院消化内科上海200065

目的检测正常胃黏膜细胞株GES-1和胃癌细胞株gnt-v的mRNA和蛋白质的表达水平。方法体外培养胃癌细胞株BGC823、SGC7901、MKN45和正常胃黏膜细胞株GES-1，应用RT-PCR、Real-time PCR、Westem blot等技术检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞Gn... 详细信息

目的检测正常胃黏膜细胞株GES-1和胃癌细胞株gnt-v的mRNA和蛋白质的表达水平。方法体外培养胃癌细胞株BGC823、SGC7901、MKN45和正常胃黏膜细胞株GES-1，应用RT-PCR、Real-time PCR、Westem blot等技术检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞gnt-v mRNA和蛋白质表达的水平。结果检测显示3株胃癌细胞（BGC823、SGC7901、MKN45）均表达CmT-v mRNA，其中BGC823、SGC7901呈高表达，MKN45则低表达gnt-v（P〈0．05）。各细胞相对正常对照组gnt-v的相对表达倍数分别为18．25，13．36，9．25。Western blot结果显示3株胃癌细胞均不同程度的gnt-v蛋白表达，而正常对照组不表达gnt-v蛋白。结论胃癌细胞不同程度表达gnt-v，各细胞中以BGC823表达量最高，SGC7901表达量居中，MKN45呈低表达，提示gnt-v可能对于胃癌的发生发展有一定的影响。

关键词： gnt-v 胃癌细胞株表达

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白细胞介素1β通过β1整合素糖基化修饰诱导***926细胞凋亡

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中国药理学通报 2012年第7期28卷 921-925页

作者：李佳佳杨竹王应雄于超重庆医科大学生命科学研究院重庆400016 重庆医科大学第二附属医院妇产科重庆400010

目的探讨IL-1β对血管内皮细胞损伤机制。方法以***926血管内皮细胞为研究对象,利用不同浓度IL-1β刺激24 h,采用Western blot方法检测IL-1β对β1整合素、Bcl-2、Bax、Caspase-3及N-乙酞氨基葡萄糖转移-v(gnt-v)表达的影响;通过Lectin ... 详细信息

目的探讨IL-1β对血管内皮细胞损伤机制。方法以***926血管内皮细胞为研究对象,利用不同浓度IL-1β刺激24 h,采用Western blot方法检测IL-1β对β1整合素、Bcl-2、Bax、Caspase-3及N-乙酞氨基葡萄糖转移-v(gnt-v)表达的影响;通过Lectin blot方法显示IL-1β对gnt-v所修饰的所有糖蛋白量的影响;免疫共沉淀方法检测IL-1β对β1整合素糖基化修饰量的变化;流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果 IL-1β可从蛋白翻译水平抑制β1整合素的表达,同时可以下调Bcl-2/Bax的比例,上调Caspase-3的表达。初步揭示IL-1β诱导血管内皮细胞凋亡可能是通过β1整合素N-连接糖基化作用来完成的。结论 IL-1β可通过调控***926细胞β1整合素的糖基化修饰,增加细胞凋亡率,损伤血管内皮细胞。

关键词： IL-1β gnt-v β1整合素 EA.hy926 糖基化凋亡

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N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶v在肿瘤发生及转移中的作用机制

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生命的化学 2011年第5期31卷 625-629页

作者：齐晶晶王丽影查锡良复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系卫生部糖复合物重点实验室上海200032

N-糖链的β-1,6分支与肿瘤关系密切。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(N-acetylglucosaminyltransferase v,gnt-v)可催化β-1,6糖链分支的生成。gnt-v是一种双功能蛋白,可以定位在高尔基体中,也可以分泌形式存在。该酶通过一种金属离子依赖的... 详细信息

N-糖链的β-1,6分支与肿瘤关系密切。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(N-acetylglucosaminyltransferase v,gnt-v)可催化β-1,6糖链分支的生成。gnt-v是一种双功能蛋白,可以定位在高尔基体中,也可以分泌形式存在。该酶通过一种金属离子依赖的丝氨酸蛋白酶来破坏细胞外基质或者直接催化促血管因子的生成来促进肿瘤的生长或转移,也可以通过分泌型的gnt-v催化糖链生成改变血管生成因子的功能,或者直接促进它们的转录从而起到促进肿瘤转移的作用。另外,gnt-v可以与癌基因产物及其受体相互作用来促进肿瘤的发生及侵袭。本综述主要就gnt-v的基本性质、促肿瘤生成及转移的机理进行展开,并展望了其在肿瘤治疗中的应用。

关键词： gnt-v 肿瘤血管生成癌基因

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沉默N-乙酰糖基转移酶v抑制CNE-2细胞的增殖和转移能力

沉默N-乙酰糖基转移酶V抑制CNE-2细胞的增殖和转移能力

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作者：李亚辉南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤,好发于华南方地区,其发病有明显的种族地区和家族地区聚集现象。据估计,世界上80%的鼻咽癌发生于我国。鼻咽癌发病率占头颈部肿瘤的首位,发病年龄在3-84岁之间,... 详细信息

一、研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国常见的恶性肿瘤,好发于华南方地区,其发病有明显的种族地区和家族地区聚集现象。据估计,世界上80%的鼻咽癌发生于我国。鼻咽癌发病率占头颈部肿瘤的首位,发病年龄在3-84岁之间,以30-50岁多见,男性发病为女性的2-3倍。鼻咽癌已经成为严重威胁我国人民生命和健康的十大恶性肿瘤之一。鼻咽癌多属低分化鳞状细胞癌,大多数对放射治疗有中度敏感性,其邻近结构对放射线亦有较高的耐受性,因此,目前治疗鼻咽癌的主要手段是放射治疗结合全身化疗。但临床发现患者的放射敏感性存在个体差异,导致治疗效果亦出现很大的不同。影响肿瘤细胞放射敏感性的因素很多,细胞凋亡是重要因素之一。自1972年Kerr发现自然界存在细胞凋亡现象以来,人们对凋亡的认识不断加深,并陆续发现了如Bcl-2等一系列的凋亡调控基因,同时也促进了鼻咽癌细胞凋亡机制的研究。糖基化是真核生物细胞表面常见的翻译后产物修饰反应中的一种。糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。蛋白的寡糖链参与了分子识别以及细胞与细胞间、细胞与间质间的识别、黏附和受体作用等多种生物功能。糖链表达量及结构的改变是普遍的恶行生物行为。细胞癌变时癌细胞膜上糖蛋白的寡糖链发生改变,即糖基异常化(aberrantglycosylation),各种异常糖蛋白糖基可影响细胞的正常功能,如细胞识别和黏附功能障碍,是导致细胞恶性转化的分子基础研究。而异常糖基化常因肿瘤细胞高尔基体上的糖基转移酶表达水平改变所致。N-糖链分支增多常与肿瘤的转移相关,如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(gnt-Ⅴ, Mgat5,能够催化形成形成β1,6-乙酰氨基葡糖分支结构)。许多研究以表明,gnt-Ⅴ活性增高以及其糖基化产物增多与细胞活力、浸润能力、以及转移能力密切相关。gnt-Ⅴ活性在许多恶性肿瘤组织中表达增高,如乳腺癌、肝癌、神经母细胞瘤、胆管癌以及鼻咽癌等,但是在非小细胞肺癌中恶性程度越高,其表达量越低。关于RNA干扰(RNA interfering, RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶Ⅲ家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),随后si RNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上,利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性(或相对特异的)结构分子作为靶点,使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法。分子靶向药物以某些肿瘤细胞膜上或细胞内特异性表达的分子为作用靶点,从而能够更加特异性地作用于特定肿瘤细胞,阻断其生长、转移或诱导其凋亡,抑制或杀死肿瘤细胞,达到控制肿瘤的目的。二、研究目的鼻咽癌是我国的高发肿瘤,目前关于gnt-Ⅴ表达与鼻咽癌关系的相关研究较少,本试验利用RNAi原理及技术,合成针对多数肿瘤细胞鼻咽癌中高表达基因gnt-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染人鼻咽癌细胞株CNE-2,观察gnt-Ⅴ的表达变化对鼻咽癌细胞株体内增殖及转移能力的影响。目的就在于能否在鼻咽癌的分子靶向治疗中找到一个新的靶点,并提供客观试验依据。三、实验方法 1、gnt-ⅤshRNA质粒制备：由上海吉玛公司完成。 2、细胞培养：转染成功的人鼻咽癌细胞株CNE-2/NC、CEN-2/2224在37℃5%CO条件下,培养于含10%新生牛血清及2000ug/ml G418的RPMI-1640中,每周传代2～3次。CNE-2细胞培养至对数生长期。 3、裸鼠皮下成瘤实验取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为2.5×107/mL,按100μL/只进行臀部皮下注射。左臀部：阴性对照组(CNE-2/NC),右臀部：干扰组(CNE-2/2224)。每组4只。在2周内每隔2天测量瘤体的长径、短径,观察瘤体体积大小变化。瘤体体积=短径2×长径/2。 4、肝脏异位种植肺转移裸鼠模型每组5只裸鼠,10%水合氯醛100μL/只行腹腔内麻醉。取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×107/mL,按50μL/只进行肝脏注射。其后继续在SPF条件下饲养。接种后2周处死裸鼠,打开腹腔,肉眼观察肝脏有无癌灶、肺脏有无转移灶,所有肝脏种植瘤及转移瘤均经病理切片HE染色,了解有无瘤体形成;并用Real Time RT-PCR、Western blot、免疫组化检测gnt-ⅤmRNA、蛋白表达水平有无改变;以及免疫组化检

关键词： gnt-v RNAi 鼻咽癌转移增殖体内

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靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对Lovo细胞转移和增殖能力的抑制作用

靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对LoVo细胞转移和增殖能力的抑制作用

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作者：贺富丽南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。糖链具有多种生物学功能,在细胞生长、分化、粘附过程中发挥着重要作用。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤。众所周... 详细信息

一、研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。糖链具有多种生物学功能,在细胞生长、分化、粘附过程中发挥着重要作用。N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤。众所周知,在肿瘤细胞中,复杂糖链的结构发生了异常改变,并且这种变化与肿瘤侵袭转移密切相关。发生这种变化的具体机制尚不清楚,但在大多数情况下,糖基转移酶的激活起着主要的作用,由此导致了所谓的肿瘤组织“异常糖基化”。 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(N-acetylglucosaminyltransferaseⅤ,gnt-Ⅴ)在N-糖蛋白的形成中有极其重要的作用,能催化形成N-糖链的β-1,6分支,β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在肿瘤组织含量丰富,特别是一些高转移潜能的肿瘤,与肿瘤的转移和恶性转化密切相关。在生物体中,RNA干扰(RNAi)是一种序列特异性的转录后基因沉默方法,它是由与目的基因序列同源的双链RNA(dsRNA)引起的。在RNAi反应中,长链dsRNA被细胞内的核糖核酸酶Ⅲ——Dicer裂解成大约21-25nt的小干扰RNA(siRNA),这些siRNA与其他蛋白联合形成RNA诱导的沉默复合体(RISC),导致同源目的基因的降解,从而导致目的基因的转录后抑制。目前关于gnt-Ⅴ表达与结直肠癌关系的相关研究较少,尚未见RNA干扰方面的研究,因此在本研究中,我们首次采用RNA干扰技术抑制gnt-Ⅴ的表达,构建了针对结直肠癌中高表达基因gnt-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人结直肠癌Lovo细胞,观察gnt-Ⅴ的表达变化对Lovo细胞体外及体内增殖及转移能力的影响,为结直肠癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。二、研究目的构建针对结直肠癌中高表达基因gnt-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染高转移潜能的人结直肠癌Lovo细胞,观察gnt-Ⅴ的表达变化对Lovo细胞体外及体内增殖及转移能力的影响,为结直肠癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。三、实验方法 1、pGPU6/GFP/Neo gnt-ⅤshRNA质粒的构建及鉴定 (1) gnt-ⅤsiRNA序列的设计:按照siRNA设计原则,利用Ambion公司提供的“siRNA Target Finder and Design Tools”,根据NCBI数据库中gnt-Ⅴ基因(NM02410.3)cDNA,设计针对gnt-ⅤcDNA的RNA片段,序列分别如下:sense 5′GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3′,sense 5′CTCCTTTGACCCTAAGAAT 3′。分别命名为gnt-Ⅴ/1564和gnt-Ⅴ/2224。将其中一对的序列打乱排列,经Blast比对,无任何同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列如下:sense 5′GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3′,命名为gnt-Ⅴ/NC。 (2) shRNA转录模板DNA的设计:根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。 (3)质粒pGPU6/GFP/Neo gnt-Ⅴ的构建及鉴定:先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽提质粒纯化。 2、细胞培养及转染人结肠癌细胞株Lovo在37℃5%CO条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2～3次。Lovo细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000将质粒导入Lovo细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。 3、干扰效果检测 (1) RT-PCR测定gnt-ⅤmRNA 用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMv逆转录合成cDNA。gnt-Ⅴ上游引物为5′AACTCTTGGACCATCCTGGGTTC 3′,下游引物为5′TTGCTGCTTTTGGGTGGGTT 3′。反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共36个循环,最后72℃再延伸10min。使用β-actin作为内参,上游引物为5′GAAACTACCTTCAACTCCATC 3′,下游引物为5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3′。gnt-Ⅴ扩增产物长度为555bp,β-actin长度为219bp。电泳后UvI凝胶成像系统摄像,Ima

关键词： gnt-v RNAi 结直肠癌转移增殖

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靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对肝癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用

靶向糖基转移酶shRNA表达质粒对肝癌细胞增殖和迁移能力的抑制作用

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作者：尧永华南方医科大学

学位级别：硕士

一、研究背景糖蛋白广泛存在于细胞膜和细胞间质中,由寡糖和蛋白质以共价方式连接而成。绝大多数寡糖是其相应的糖蛋白的功能中心,在细胞识别、信号传递中起关键作用。糖链的形式有多种,其中N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤... 详细信息

一、研究背景糖蛋白广泛存在于细胞膜和细胞间质中,由寡糖和蛋白质以共价方式连接而成。绝大多数寡糖是其相应的糖蛋白的功能中心,在细胞识别、信号传递中起关键作用。糖链的形式有多种,其中N-糖链的结构改变是细胞恶性转化的关键步骤。多数研究证明在肿瘤细胞中,常发现糖蛋白结构的异常增加,出现了肿瘤组织“异常糖基化”。发生这种变化的具体机制尚不清楚,但在大多数情况下,糖基转移酶的激活起着主要的作用。糖基转移酶在糖蛋白的合成中起关键作用。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶分布于高尔基体,其主要功能是在核心五糖基础上形成多分支结构,将供体底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的GlcNAc (Gn)糖基转移至N-聚糖五糖核心的两个甘露糖。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶至少有6种,其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v(N-acetylglucosaminyltransferase v, gnt-v)是目前研究最多的。在正常体内,gnt-v是参与N-糖链生物合成的酶类,是糖蛋白N-糖链加工酶之一,具有决定N-糖链类型及复杂型糖链结构的重要作用。在高尔基体内催化形成N-糖链的β1,6分支,将核糖体合成的蛋白进行糖基化修饰。在多数肿瘤细胞中,细胞表面出现分子量更大的糖链,主要就是gnt-v高表达引起N-糖链β1,6分支增加,GlcNAcβ1,6 Man a 1,6结构有利于外链的延伸,可进一步合成N-乙酰氨基乳糖重复顺序。已发现该结构与细胞的恶性转化和肿瘤的转移有密切关系。采用L-PHA凝集素(可以特异识别β1,6分支糖链结构)分析了几种不同的肿瘤细胞,发现β1,6分支结构糖链的增加与gnt-v活性增高完全一致。Chakraborty等则证实肿瘤细胞表面β1,6分支天冬酰胺连接型糖链的存在促进其对基膜的入侵。 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v (N-acetylglucosaminyltransferase v, gnt-v)除了具有糖基转移酶催化活性这一特征外,最近有研究表明N-乙酰氨基葡萄糖转移酶v是一个高尔基体酶,在某些肿瘤细胞中,可被分泌到培养基中,其分泌机制还不能确定。但是被分泌出细胞的gnt-v在生理浓度范围内能引起肿瘤血管生成,而肿瘤血管生成是肿瘤转移的关键。 RNAi技术是指在生物体细胞中,外源性或内源性的双链RNA (double2st randed RNA, dsRNA)引起与其同源mRNA的特异性降解,而抑制其相应基因表达的过程。RNA干扰具有高效性,稳定性,特异性等优点,它选择性地沉默肿瘤细胞内的癌基因和抑癌基因,抑制其功能表达,分析其表型的改变,有利于揭示肿瘤发生与病变的分子机制,从而为肿瘤的诊断和治疗提供治疗靶点。本课题旨在利用RNA干扰技术,将靶向针对gnt-v的shRNA质粒转染进肝癌细胞,用cck-8增殖实验,划痕实验,趋化运动试验以及体内皮下成瘤实验来观察肝癌细胞增殖和迁移能力的改变,为肝癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。二、研究目的将靶向针对高表达基因gnt-v的shRNA表达质粒转染进人肝癌HepG2细胞,观察gnt-v的表达变化对HepG2细胞体外及体内增殖和迁移能力的影响,为肝癌分子靶向治疗研究中新靶标的确定提供客观依据。三、实验方法 1、pGPU6/GFP/Neo gnt-vshRNA质粒的构建及鉴定已由本课题组成员贺富丽完成,方法如下： a. gnt-vsiRNA序列的设计：按照siRNA设计原则,利用Ambion公司提供的"siRNA Target Finder and Design Tools",根据NCBI数据库中gnt-v基因(NM02410.3) cDNA,设计针对gnt-v cDNA的RNA片段,序列分别如下：sense 5’GGAAGTGCATGCAACTGTTTA 3’, sense 5’CTCCTTTGA CCCTAAGAAT3’。分别命名为gnt-v/1564和gnt-v/2224。将其中一对的序列打乱排列,经Blast比对,无任何同源性超过70%的序列,作为阴性对照干扰序列,序列如下：sense 5’GTTCTCCGAACGTGTCACGT 3’,命名为gnt-v/NC。 b. shRNA转录模板DNA的设计：根据前面设计的siRNA序列,设计模板DNA链,其顺序分别为BbsⅠ酶切位点、正义序列、9nt loop连接序列、反义序列、RNA聚合酶Ⅲ终止子(6个T)、BamHⅠ酶切位点。 c.质粒pGPU6/GFP/Neo gnt-v的构建及鉴定：先将各组2条模板单链退火处理,再与双酶切后的pGPU6/GFP/Neo质粒连接,构建成重组体质粒。将重组体转化大肠杆菌DH5α,筛选卡那霉素抗性克隆,利用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切及测序鉴定重组质粒。大量扩增摇菌后,抽

关键词： gnt-v RNAi 肝癌增殖迁移

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N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-v与前列腺癌恶性生物学行为的关系

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V与前列腺癌恶性生物学行为的关系

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作者：刘秋连南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,细胞膜上的糖蛋白糖链结构与肿瘤的粘附、入侵及转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-v, gnt-v)为糖蛋白N-糖链加工酶之一,起着决定N-粮链类... 详细信息

研究背景生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,细胞膜上的糖蛋白糖链结构与肿瘤的粘附、入侵及转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-v, gnt-v)为糖蛋白N-糖链加工酶之一,起着决定N-粮链类型及复杂型糖链结构的重要作用,主要分布在高尔基体中,能催化形成N-糖链的β-1,6分支,p-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在肿瘤组织含量丰富,与肿瘤的转移、恶性转化等生物学活性密切相关。gnt-v影响肿瘤生物活性主要是通过改变细胞表面糖蛋白如钙黏蛋白、整合素及细胞表面生长因子受体的β-1,6分支结构。另外分泌型gnt-v在肿瘤细胞外基质中有一种引起肿瘤血管生成的新功能,而且与糖基转移酶催化活性无关。gnt-v (?)舌性在许多恶性肿瘤组织中表达增高,如乳腺癌、结肠癌和肝癌。人乳腺癌细胞系中,gnt-v表达与肿瘤的大小成正相关;高转移结肠癌细胞株中,gnt-v (?)舌性与肿瘤侵袭转移能力成正相关。然而,在非小细胞肺癌和膀胱癌中,gnt-v的表达量越低,肿瘤的恶性程度反而越高。因此,gnt-v在不同肿瘤中的作用是不一样的。前列腺癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一,发病随年龄而增氏,其发病率有明显的地区差异,欧美地区较高。据报道仅次于肺癌,在男性是癌症死亡的第二位。前列腺癌主要治疗手段有根治性手术和内分泌治疗、放疗及化疗。根治术后复发、发生远处转移及无法耐受手术的患者多选择内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者,大多数起初有效,但经过中位时间14-30个月后,几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌。如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌依然是基础和临床研究的热点和难点。化疗常用于激素非依赖性前列腺癌,但对患者的治疗效果仍有限。而放射治疗可对局限性前列腺癌进行根治性放疗,也可作为手术治疗的辅助治疗和晚期患者的姑息性治疗。但临床发现部分病人因放疗抵抗导致放疗后局部复发,以致患者预后不佳。已经发现的和前列腺癌细胞放射敏感性有关的预测分子有Raf激酶抑制白,PAK6蛋白和DAB2IP基因等。但是目前为止尚未有一个公认的标志性分子能预测前列腺癌细胞的放射敏感性。二、研究目的虽然很多研究表明gnt-v和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是目前关于gnt-v与前列腺癌恶性生物学行为的相研究较少,因此在本研究中,我们采用免疫组化检测gnt-v在前列腺癌组织中的表达情况,以期探讨gnt-v在前列腺癌发生、发展及转移中的作用。同时我们利用shRNA,下调前列腺癌细胞PC3中gnt-v的表达量,得到了低表达gnt-v的细胞株PC3gnt-v/1564及PC3gnt-v/1079。通过体内及体外实验对比正常的前列腺癌细胞和低表达gnt-v的前列腺癌细胞的放射敏感性,更重要的是,还研究了gnt-v对前列腺癌细胞放射敏感性的内在机制。三、实验方法 1、前列腺癌组织芯片制作：由陕西超英生物科技有限公司完成。 2、pGPU6/GFP/Neo gnt-v shRNA质粒的构建及鉴定：由上海吉玛公司完成 3、细胞培养及转染人前列腺癌细胞株PC3在37℃5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2-3次。PC3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC3细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。 4、干扰效果检测 (1) RT-PCR测定gnt-v mRNA 用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMv逆转录合成***-v上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA3’。使用β-actin作为内参,上游引物为5’GAAACTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCC AGGATGGAGCCGCC3’.反应条件为：95℃预变性30s,PCR：94℃5s,60℃30s,共40个循环,溶解曲线：95℃0s,65℃60s,95℃0s. 基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct(C为Cycle,t为threshold)值,ACT代表目的基因相对于内参基因的表达强度,公式为ACT=Ct目的基因-Ct内参基因。用Folds=2-△△Ct表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系,AACt=ACT实验组-ACT对照组。目的基因为gnt-v,内参基因为β-actin。 (2) Western blot检测gnt-v蛋白表达提取总蛋白,髟测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上

关键词： gnt-v shRNA 前列腺癌放射敏感性

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