N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-V与前列腺癌恶性生物学行为的关系

作     者：刘秋连 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张健

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：GnT-V shRNA 前列腺癌 放射敏感性 

摘      要：研究背景 生物体内的大多数蛋白质都以糖蛋白的形式存在,细胞膜上的糖蛋白糖链结构与肿瘤的粘附、入侵及转移密切相关。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-V, GnT-V)为糖蛋白N-糖链加工酶之一,起着决定N-粮链类型及复杂型糖链结构的重要作用,主要分布在高尔基体中,能催化形成N-糖链的β-1,6分支,p-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在肿瘤组织含量丰富,与肿瘤的转移、恶性转化等生物学活性密切相关。GnT-V影响肿瘤生物活性主要是通过改变细胞表面糖蛋白如钙黏蛋白、整合素及细胞表面生长因子受体的β-1,6分支结构。另外分泌型GnT-V在肿瘤细胞外基质中有一种引起肿瘤血管生成的新功能,而且与糖基转移酶催化活性无关。GnT-V (?)舌性在许多恶性肿瘤组织中表达增高,如乳腺癌、结肠癌和肝癌。人乳腺癌细胞系中,GnT-V表达与肿瘤的大小成正相关;高转移结肠癌细胞株中,GnT-V (?)舌性与肿瘤侵袭转移能力成正相关。然而,在非小细胞肺癌和膀胱癌中,GnT-V的表达量越低,肿瘤的恶性程度反而越高。因此,GnT-V在不同肿瘤中的作用是不一样的。 前列腺癌是泌尿生殖系最常见的恶性肿瘤之一,发病随年龄而增氏,其发病率有明显的地区差异,欧美地区较高。据报道仅次于肺癌,在男性是癌症死亡的第二位。前列腺癌主要治疗手段有根治性手术和内分泌治疗、放疗及化疗。根治术后复发、发生远处转移及无法耐受手术的患者多选择内分泌治疗。接受内分泌治疗的患者,大多数起初有效,但经过中位时间14-30个月后,几乎都将逐渐发展为激素非依赖性前列腺癌或激素难治性前列腺癌。如何有效地治疗激素非依赖性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌依然是基础和临床研究的热点和难点。化疗常用于激素非依赖性前列腺癌,但对患者的治疗效果仍有限。而放射治疗可对局限性前列腺癌进行根治性放疗,也可作为手术治疗的辅助治疗和晚期患者的姑息性治疗。但临床发现部分病人因放疗抵抗导致放疗后局部复发,以致患者预后不佳。已经发现的和前列腺癌细胞放射敏感性有关的预测分子有Raf激酶抑制白,PAK6蛋白和DAB2IP基因等。但是目前为止尚未有一个公认的标志性分子能预测前列腺癌细胞的放射敏感性。 二、研究目的 虽然很多研究表明GnT-V和多种肿瘤的恶性生物学行为密切相关,但是目前关于GnT-V与前列腺癌恶性生物学行为的相研究较少,因此在本研究中,我们采用免疫组化检测GnT-V在前列腺癌组织中的表达情况,以期探讨GnT-V在前列腺癌发生、发展及转移中的作用。同时我们利用shRNA,下调前列腺癌细胞PC3中GnT-V的表达量,得到了低表达GnT-V的细胞株PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079。通过体内及体外实验对比正常的前列腺癌细胞和低表达GnT-V的前列腺癌细胞的放射敏感性,更重要的是,还研究了GnT-V对前列腺癌细胞放射敏感性的内在机制。 三、实验方法 1、前列腺癌组织芯片制作：由陕西超英生物科技有限公司完成。 2、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA质粒的构建及鉴定：由上海吉玛公司完成 3、细胞培养及转染 人前列腺癌细胞株PC3在37℃5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周传代2-3次。PC3细胞培养至对数生长期,参照invitrogen公司Lipofectamine2000TM产品说明书,用脂质体Lipofectamine2000TM将质粒导入PC3细胞。用G418筛选阳性细胞克隆。 4、干扰效果检测 (1) RT-PCR测定GnT-V mRNA 用Trizol提取对数生长期的单层培养细胞总RNA,采用AMV逆转录合成***-V上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA3’。使用β-actin作为内参,上游引物为5’GAAACTACCTTCAACTCCATC3’下游引物为5’CGAGGCC AGGATGGAGCCGCC3’.反应条件为：95℃预变性30s,PCR：94℃5s,60℃30s,共40个循环,溶解曲线：95℃0s,65℃60s,95℃0s. 基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct(C为Cycle,t为threshold)值,ACT代表目的基因相对于内参基因的表达强度,公式为ACT=Ct目的基因-Ct内参基因。用Folds=2-△△Ct表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系,AACt=ACT实验组-ACT对照组。目的基因为GnT-V,内参基因为β-actin。 (2) Western blot检测GnT-V蛋白表达 提取总蛋白,髟测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上