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稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体glua1亚基单克隆细胞株的构建

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解剖学报 2018年第5期49卷 591-597页

作者：李炯张吉凤赵波蔡振彬朱肖楠郭国庆暨南大学基础医学院解剖学系广州510632 暨南大学附属第一医院康复科广州510630 暨南大学附属第一医院骨科广州510630

目的构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体glua1亚基的细胞株。方法PCR扩增glua1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV. 0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细胞,... 详细信息

目的构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体glua1亚基的细胞株。方法PCR扩增glua1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV. 0-绿色荧光蛋白(GFP),采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定glua1的表达与功能。结果菌落PCR鉴定扩增产物与glua1分子量(2724 bp)一致,经测序插入慢病毒载体序列与glua1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,glua1在过表达glua1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达。单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面glua1蛋白表达相对一致。单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达glua1组可记录5~40 p A电信号。结论成功构建了稳定表达AMPA受体glua1亚基的HEK293T细胞株。

关键词： glua1亚基慢病毒单克隆细胞株实时定量聚合酶链反应免疫印迹法

M1胆碱受体通过AMPA受体glua1亚基改善β-淀粉样肽导致的学习记忆功能障碍

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第6期33卷 447-448页

作者：赵兰雪陈牧文钱悦杨前昊葛艳慧陈红专邱瑜上海交通大学医学院药理学与化学生物学系

目的碱型乙酰胆碱受体(M受体)亚型M1受体在脑内的分布量最大,并且在大脑皮质和海马中大量表达,发挥着重要的促进学习和记忆的功能。M1受体是治疗以胆碱神经元丢失、淀粉样斑块沉积等为病理特征的神经退行性疾病阿尔茨海默病(AD)的潜在... 详细信息

目的碱型乙酰胆碱受体(M受体)亚型M1受体在脑内的分布量最大,并且在大脑皮质和海马中大量表达,发挥着重要的促进学习和记忆的功能。M1受体是治疗以胆碱神经元丢失、淀粉样斑块沉积等为病理特征的神经退行性疾病阿尔茨海默病(AD)的潜在治疗靶标。我们前期研究发现,选择性激活M1受体可促进AMPA受体glua1亚基向神经元表面和突触后膜运输,并且在激动M1受体促进学习记忆中起着重要作用。本研究进一步探讨AMPA受体glua1亚基在M1受体改善β-淀粉样肽(Aβ)所致学习记忆障碍中的作用。方法选用野生型和AMPA受体glua1亚基Ser845位点突变小鼠(S845A小鼠),以3次脑室内注射Aβ纤丝以破坏学习记忆功能,通过Morris水迷宫实验研究给予M1受体选择性激动剂77-LH-28-1对野生小鼠和突变小鼠的学习记忆的改善作用。实验结束后收集海马组织进行Western蛋白印迹法和免疫荧光检测,研究77-LH-28-1对海马组织内glua1亚基表达及其向突触转运的影响。结果 Morris水迷宫实验表明,S845A小鼠的空间学习记忆能力与野生型小鼠相同,表明S845A小鼠学习记忆功能未受损。给予3次脑室内Aβ纤丝注射使野生型和S845A小鼠的空间记忆能力受损,给予M1受体选择性激动剂77-LH-28-1可明显缩短野生型小鼠寻找平台的潜伏期和游泳路程,但对S845A小鼠无明显作用。Morris水迷宫训练期24 h后进行目标象限探索实验,结果表明,77-LH-28-1可使注射Aβ纤丝的野生型小鼠在目标象限的时间和路程百分百显著提高,与正常野生小鼠无区别,而这些作用在注射Aβ纤丝的S845A小鼠都缺失。并且各组小鼠的游泳速度不存在显著性差异,说明M1受体激动通过glua1亚基显著改善了Aβ所致的空间学习和记忆障碍。Western蛋白印迹法检测表明,77-LH-28-1提高野生型小鼠海马内glua1亚基的表达及其Ser845位点的磷酸化。免疫荧光检测表明,77-LH-28-1提高野生型小鼠海马内glua1亚基与突触后蛋白PSD95的共定位,而这些作用在S845A小鼠中缺失。结论选择性激动M1受体显著改善Aβ所致的学习记忆障碍,该作用与其调控对AMPA受体glua1亚基的调控有关。激动M1受体可使glua1亚基Ser845位点的磷酸化程度增加,并由此增加glua1的表达和向突触后的转运。Ser845位点突变可阻断M1受体对glua1亚基的调控作用从而不能改善Aβ所致的学习记忆障碍。本研究揭示了M1受体改善学习记忆的分子机制。

关键词： M1胆碱受体 AMPA受体 glua1亚基 β-淀粉样肽阿尔茨海默病学习记忆

M1胆碱受体通过AMPA受体glua1亚基改善β-淀粉样肽导致的学习记忆功能障碍

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M1胆碱受体通过AMPA受体GluA1亚基改善β-淀粉样肽导致的学习记忆...

脊髓背角RCAN1.4在外周炎症诱发痛觉敏感化中的作用

2019全国老年痴呆与认知障碍相关疾病学术大会

作者：赵兰雪陈牧文钱悦杨前昊葛艳慧陈红专邱瑜上海交通大学医学院药理学与化学生物学系

目的碱型乙酰胆碱受体(M受体)亚型M1受体在脑内的分布量最大,并且在大脑皮质和海马中大量表达,发挥着重要的促进学习和记忆的功能。M1受体是治疗以胆碱神经元丢失、淀粉样斑块沉积等为病理特征的神经退行性疾病阿尔茨海默病(AD)的潜在治疗靶标。我们前期研究发现,选择性激活M1受体可促进AMPA受体glua1亚基向神经元表面和突触后膜运输,并且在激动M1受体促进学习记忆中起着重要作用。本研究进一步探讨AMPA受体glua1亚基在M1受体改善β-淀粉样肽(Aβ)所致学习记忆障碍中的作用。方法选用野生型和AMPA受体glua1亚基Ser845位点突变小鼠(S845A小鼠),以3次脑室内注射Aβ纤丝以破坏学习记忆功能,通过Morris水迷宫实验研究给予M1受体选择性激动剂77-LH-28-1对野生小鼠和突变小鼠的学习记忆的改善作用。实验结束后收集海马组织进行Western蛋白印迹法和免疫荧光检测,研究77-LH-28-1对海马组织内glua1亚基表达及其向突触转运的影响。结果Morris水迷宫实验表明,S845A小鼠的空间学习记忆能力与野生型小鼠相同,表明S845A小鼠学习记忆功能未受损。给予3次脑室内Aβ纤丝注射使野生型和S845A小鼠的空间记忆能力受损,给予M1受体选择性激动剂77-LH-28-1可明显缩短野生型小鼠寻找平台的潜伏期和游泳路程,但对S845A小鼠无明显作用。Morris水迷宫训练期24 h后进行目标象限探索实验,结果表明,77-LH-28-1可使注射Aβ纤丝的野生型小鼠在目标象限的时间和路程百分百显著提高,与正常野生小鼠无区别,而这些作用在注射Aβ纤丝的S845A小鼠都缺失。并且各组小鼠的游泳速度不存在显著性差异,说明M1受体激动通过glua1亚基显著改善了Aβ所致的空间学习和记忆障碍。Western蛋白印迹法检测表明,77-LH-28-1提高野生型小鼠海马内glua1亚基的表达及其Ser845位点的磷酸化。免疫荧光检测表明,77-LH-28-1提高野生型小鼠海马内glua1亚基与突触后蛋白PSD95的共定位,而这些作用在S845A小鼠中缺失。结论选择性激动M1受体显著改善Aβ所致的学习记忆障碍,该作用与其调控对AMPA受体glua1亚基的调控有关。激动M1受体可使glua1亚基Ser845位点的磷酸化程度增加,并由此增加glua1的表达和向突触后的转运。Ser845位点突变可阻断M1受体对glua1亚基的调控作用从而不能改善Aβ所致的学习记忆障碍。本研究揭示了M1受体改善学习记忆的分子机制。

关键词： M1胆碱受体 AMPA受体 glua1亚基 β-淀粉样肽阿尔茨海默病学习记忆

来源： cnki会议评论

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脊髓背角RCAN1.4在外周炎症诱发痛觉敏感化中的作用

作者：白雪兰州大学

学位级别：硕士

目的:钙调神经磷酸酶调节因子1(Regulator of calcineurin 1,RCAN1)是钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)的一种内源性调节因子。本研究旨在探究脊髓背角中的RCAN1在痛觉调控中发挥的可能作用。方法:通过小鼠足底皮下注射完全弗式佐剂(Com... 详细信息

目的:钙调神经磷酸酶调节因子1(Regulator of calcineurin 1,RCAN1)是钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)的一种内源性调节因子。本研究旨在探究脊髓背角中的RCAN1在痛觉调控中发挥的可能作用。方法:通过小鼠足底皮下注射完全弗式佐剂(Complete Freund’s Adjuvant,CFA)的方法建立慢性炎性疼痛模型;利用免疫组织化学法观察RCAN1在小鼠脊髓背角中的分布;利用梯度离心分离亚细胞组分的方法检测全细胞和突触组分中RCAN1的含量;利用免疫印迹法检测α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor,AMPA受体)的表达以及glua1亚基Ser845位点的磷酸化;利用免疫共沉淀法研究CaN与RCNA1.4之间的相互作用;通过检测机械性缩足阈值(Paw Withdrawal Thresholds,PWTs)、动态评分、丙酮冷刺激反应和热缩足潜伏期(Paw Withdrawal Latencies,PWLs)评价小鼠脊髓背角过表达和敲低RCAN1.4对小鼠的痛阈的影响。结果:(1)RCAN1与脊髓背角中神经元的标记物NeuN共标记,与小胶质细胞标记物OX42和星型胶质细胞标记物GFAP没有共标记;且大部分RCAN1阳性细胞表达于CGRP阳性(CGRP)纤维所标记的Ⅱ板层背侧。(2)脊髓背角主要表达RCNA1.1和RCNA 1.4两种亚型。CFA诱导的外周炎症可显著增加RCAN1.4的总蛋白和突触表达水平,而不影响RCAN1.1蛋白的表达。(3)CFA诱导的外周炎症可提高脊髓背角神经元中RCAN1.4与CaN的相互作用。(4)正常小鼠脊髓背角过表达RCAN1.4可以诱发机械性痛觉超敏(mechanical allodynia)、冷痛觉超敏(cold allodynia)以及热痛觉过敏(thermal hyperalgesia)反应。(5)敲低脊髓背角RCAN1.4的表达,可有效缓解炎症小鼠的机械性痛觉超敏、冷痛觉超敏以及热痛觉过敏反应。(6)在正常小鼠脊髓背角中过表达RCAN1.4增加AMPA受体glua1亚基的突触含量和Ser845位的磷酸化。(7)敲低脊髓背角RCAN1.4,可显著降低炎症小鼠脊髓背角AMPA受体glua1亚基的突触含量和glua1亚基Ser845位的磷酸化。结论:RCAN1主要分布在脊髓背角浅层神经元中;外周炎症诱导的RCAN-1.4表达的上调能够增加AMPA受体glua1亚基的磷酸化和突触含量,参与痛觉敏感化的形成;干预RCAN1.4的表达能有效抑制慢性疼痛症状。

关键词：钙调神经磷酸酶调节因子1 AMPA受体 glua1亚基疼痛

绿原酸通过抑制AMPA受体的突触表达缓解慢性炎性疼痛

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中国药理学通报 2021年第9期37卷 1251-1256页

作者：李银霞高敏白雪刘燕妮张亦涵索占伟兰州大学药学院分子药理研究所甘肃兰州730000

目的研究绿原酸(chorogenic acid,CGA)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)所诱发的慢性疼痛症状的影响,并通过检测CGA对炎性小鼠脊髓背角AMPA受体突触表达的影响,探讨其作用机制。方法小鼠后足底皮下注射CFA,以诱导机械... 详细信息

目的研究绿原酸(chorogenic acid,CGA)对完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)所诱发的慢性疼痛症状的影响,并通过检测CGA对炎性小鼠脊髓背角AMPA受体突触表达的影响,探讨其作用机制。方法小鼠后足底皮下注射CFA,以诱导机械性痛觉超敏和热痛觉过敏;鞘内给予CGA,实时测定机械性缩足阈值(PWT)及热刺激潜伏期(PWL)的变化;分离脊髓背角,应用免疫印迹法检测AMPA受体亚基glua1、glua2的突触表达和磷酸化水平。结果鞘内注射CGA可剂量依赖性地提高疼痛小鼠的PWT和PWL;高剂量(200 ng)CGA对正常小鼠基础痛阈、运动机能并未产生明显影响;中剂量(100 ng)CGA可有效逆转CFA所诱发的glua1亚基的突触表达亢进,并明显降低炎性小鼠glua1-Ser845的磷酸化水平,但未影响glua1-Ser831的磷酸化。结论CGA可通过特异性逆转脊髓背角glua1-Ser845的过磷酸化、降低glua1的突触表达而产生镇痛效应。

关键词：绿原酸 AMPA受体 glua1亚基磷酸化炎性疼痛脊髓背角

脊髓背角AKAP150及其棕榈酰化在炎性疼痛中的作用

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脊髓背角AKAP150及其棕榈酰化在炎性疼痛中的作用

作者：李银霞兰州大学

学位级别：硕士

目的:A激酶锚定蛋白150（A-kinase anchoring protein 150;AKAP150）通过组织蛋白激酶A（protein kinase A;PKA）、蛋白激酶C（protein kinase C;PKC）和钙调神经磷酸酶（protein phosphatase 2B/calcineurin;PP2B/Ca N）调控AMPA受体（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors;AMPARs）等离子通道,参与突触可塑性。AKAP150可发生棕榈酰化修饰,深刻影响蛋白的空间分布及功能发挥。本研究旨在揭示AKAP150及其棕榈酰化对脊髓背角AMPAR的调控作用以及在慢性炎性疼痛中的作用。方法:小鼠后足底皮下注射完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant;CFA）制备慢性炎性疼痛模型;利用梯度离心法结合去垢剂裂解法分离亚细胞组分,研究蛋白的亚细胞分布和突触表达;利用酰基生物素交换法（acy-biotinyl exchange assay;ABE）检测蛋白的棕榈酰化水平;利用Western Blot检测蛋白表达及磷酸化水平;利用免疫共沉淀法,研究蛋白间的相互作用;通过构建、转染AKAP150（C36,123S）-p EGFPN1质粒,研究棕榈酰化在AKAP150分布、AMPAR突触表达以及痛觉敏化中的作用;通过制备、转染siRNA,研究敲低AKAP150、酰基转移酶ZDHHC2对AMPAR及痛觉敏感化的影响;通过检测机械性缩足阈值（PWTs）和热缩足潜伏期值（PWLs）,观察痛行为学的变化。结果:（1）小鼠后足底皮下注射CFA,虽不影响脊髓背角AKAP150在全细胞匀浆液（H）中的含量,但可显著增加AKAP150在突触体膜组分（P2）和富含PSD的突触后致密组分（P3）中的含量,并且降低其在可溶性胞质组分（S2）中的含量,说明外周炎症可提高AKAP150的突触表达。（2）小鼠后足底皮下注射CFA,可增加脊髓背角AKAP150与PSD95的相互作用,并且显著增强PKA、PKC与AKAP150的结合,而减弱Ca N与AKAP150的结合,说明外周炎症可能引发AKAP150信号复合物的重组。（3）小鼠后足底皮下注射CFA,可显著提高AKAP150的棕榈酰化水平;脊髓背角表达AKAP150棕榈酰化位点突变体AKAP150（C36,123S）,可显著抑制CFA诱发的AKAP150的突触表达增强,提示:AKAP150棕榈酰化是外周炎症诱导AKAP150突触再分布所必需的。（4）皮下注射CFA可特异性提高AMPAR亚基glua1的突触表达,而鞘内给予AKAP150-siRNA敲低AKAP150的表达,可显著抑制CFA所诱发的glua1的突触表达亢进;脊髓背角表达野生型AKAP150可直接提高glua1的突触表达,提示了AKAP150对glua1有重要调控作用。（5）鞘内给予可打断PKA与AKAPs结合的多肽St-Ht31或可干扰PKC与AKAP150结合的多肽TAT-AKAP150（31-51）,均可有效逆转CFA诱发的glua1的突触表达亢进;脊髓背角表达缺失PKA或PKC结合域的AKAP150突变体AKAP150ΔPKA或AKAP150ΔPKC,也均可显著抑制CFA诱发的glua1的突触表达亢进,提示:在炎症条件下,AKAP150所携带的蛋白激酶在glua1的突触募集中发挥重要作用。（6）鞘内注射广谱性棕榈酰化抑制剂2-BP（200 ng）或脊髓背角表达AKAP150（C36,123S）,均可显著抑制CFA诱发的glua1的突触募集及glua1亚基Ser845和Ser831的过磷酸化,说明AKAP150的棕榈酰化在glua1突触表达亢进中发挥着重要作用。（7）CFA可显著提高脊髓背角ZDHHC2的总蛋白表达及突触含量,与此同时,提高了ZDHHC2与AKAP150的结合;脊髓背角转染ZDHHC2-siRNA可显著抑制CFA诱发的glua1的突触募集及glua1的过磷酸化,提示了ZDHHC2是CFA诱发AKAP150棕榈酰化、glua1突触表达亢进的始动因素。（8）脊髓背角表达AKAP150（C36,123S）或敲低ZDHHC2均可有效抑制CFA诱发机械性痛觉超敏和热痛觉过敏的形成;鞘内给予2-BP可剂量依赖性减轻炎性动物的痛觉过敏症状。结论:脊髓背角AKAP150信号复合物及AKAP150的棕榈酰化通过调节包含glua1亚基的AMPAR的突触运输,在外周炎症致中枢敏感化中发挥重要作用。抑制AKAP150的棕榈酰化可减轻慢性疼痛症状。

关键词： AKAP150 棕榈酰化 AMPA受体 glua1亚基 CFA 痛觉敏感化