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脊髓背角AKAP150及其棕榈酰化在炎性疼痛中的作用

脊髓背角AKAP150及其棕榈酰化在炎性疼痛中的作用

作     者:李银霞 

作者单位:兰州大学 

学位级别:硕士

导师姓名:索占伟

授予年度:2021年

学科分类:1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100104[医学-病理学与病理生理学] 10[医学] 

主      题:AKAP150 棕榈酰化 AMPA受体 GluA1亚基 CFA 痛觉敏感化 

摘      要:目的:A激酶锚定蛋白150(A-kinase anchoring protein 150;AKAP150)通过组织蛋白激酶A(protein kinase A;PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C;PKC)和钙调神经磷酸酶(protein phosphatase 2B/calcineurin;PP2B/Ca N)调控AMPA受体(α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors;AMPARs)等离子通道,参与突触可塑性。AKAP150可发生棕榈酰化修饰,深刻影响蛋白的空间分布及功能发挥。本研究旨在揭示AKAP150及其棕榈酰化对脊髓背角AMPAR的调控作用以及在慢性炎性疼痛中的作用。方法:小鼠后足底皮下注射完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant;CFA)制备慢性炎性疼痛模型;利用梯度离心法结合去垢剂裂解法分离亚细胞组分,研究蛋白的亚细胞分布和突触表达;利用酰基生物素交换法(acy-biotinyl exchange assay;ABE)检测蛋白的棕榈酰化水平;利用Western Blot检测蛋白表达及磷酸化水平;利用免疫共沉淀法,研究蛋白间的相互作用;通过构建、转染AKAP150(C36,123S)-p EGFPN1质粒,研究棕榈酰化在AKAP150分布、AMPAR突触表达以及痛觉敏化中的作用;通过制备、转染siRNA,研究敲低AKAP150、酰基转移酶ZDHHC2对AMPAR及痛觉敏感化的影响;通过检测机械性缩足阈值(PWTs)和热缩足潜伏期值(PWLs),观察痛行为学的变化。结果:(1)小鼠后足底皮下注射CFA,虽不影响脊髓背角AKAP150在全细胞匀浆液(H)中的含量,但可显著增加AKAP150在突触体膜组分(P2)和富含PSD的突触后致密组分(P3)中的含量,并且降低其在可溶性胞质组分(S2)中的含量,说明外周炎症可提高AKAP150的突触表达。(2)小鼠后足底皮下注射CFA,可增加脊髓背角AKAP150与PSD95的相互作用,并且显著增强PKA、PKC与AKAP150的结合,而减弱Ca N与AKAP150的结合,说明外周炎症可能引发AKAP150信号复合物的重组。(3)小鼠后足底皮下注射CFA,可显著提高AKAP150的棕榈酰化水平;脊髓背角表达AKAP150棕榈酰化位点突变体AKAP150(C36,123S),可显著抑制CFA诱发的AKAP150的突触表达增强,提示:AKAP150棕榈酰化是外周炎症诱导AKAP150突触再分布所必需的。(4)皮下注射CFA可特异性提高AMPAR亚基GluA1的突触表达,而鞘内给予AKAP150-siRNA敲低AKAP150的表达,可显著抑制CFA所诱发的GluA1的突触表达亢进;脊髓背角表达野生型AKAP150可直接提高GluA1的突触表达,提示了AKAP150对GluA1有重要调控作用。(5)鞘内给予可打断PKA与AKAPs结合的多肽St-Ht31或可干扰PKC与AKAP150结合的多肽TAT-AKAP150(31-51),均可有效逆转CFA诱发的GluA1的突触表达亢进;脊髓背角表达缺失PKA或PKC结合域的AKAP150突变体AKAP150ΔPKA或AKAP150ΔPKC,也均可显著抑制CFA诱发的GluA1的突触表达亢进,提示:在炎症条件下,AKAP150所携带的蛋白激酶在GluA1的突触募集中发挥重要作用。(6)鞘内注射广谱性棕榈酰化抑制剂2-BP(200 ng)或脊髓背角表达AKAP150(C36,123S),均可显著抑制CFA诱发的GluA1的突触募集及GluA1亚基Ser845和Ser831的过磷酸化,说明AKAP150的棕榈酰化在GluA1突触表达亢进中发挥着重要作用。(7)CFA可显著提高脊髓背角ZDHHC2的总蛋白表达及突触含量,与此同时,提高了ZDHHC2与AKAP150的结合;脊髓背角转染ZDHHC2-siRNA可显著抑制CFA诱发的GluA1的突触募集及GluA1的过磷酸化,提示了ZDHHC2是CFA诱发AKAP150棕榈酰化、GluA1突触表达亢进的始动因素。(8)脊髓背角表达AKAP150(C36,123S)或敲低ZDHHC2均可有效抑制CFA诱发机械性痛觉超敏和热痛觉过敏的形成;鞘内给予2-BP可剂量依赖性减轻炎性动物的痛觉过敏症状。结论:脊髓背角AKAP150信号复合物及AKAP150的棕榈酰化通过调节包含GluA1亚基的AMPAR的突触运输,在外周炎症致中枢敏感化中发挥重要作用。抑制AKAP150的棕榈酰化可减轻慢性疼痛症状。

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