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月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的克隆及表达分析

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中国农业科学 2012年第3期45卷 590-597页

作者：晏慧君张颢蹇洪英王其刚邱显钦张婷唐开学云南省农业科学院花卉研究所/云南省花卉育种重点实验室

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物... 详细信息

【目的】克隆月季丁香酚合成酶基因RhEGS1的全长cDNA序列,分析其序列及表达特征,并对该基因编码的蛋白进行原核表达分析,为深入探讨丁香酚合成酶的生化特性奠定基础。【方法】根据已发表的其它植物EGS基因序列的保守结构域设计简并引物,结合RACE技术,获得RhEGS1的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期RhEGS1进行表达分析。采用gateway克隆技术,构建原核表达载体,并进行原核蛋白表达。【结果】月季RhEGS1的cDNA全长为1 207 bp,包含一个927 bp的ORF,编码309个氨基酸。同源序列比对发现RhEGS1与仙女扇的CbEGS2有83.87%的同源性,与矮牵牛PhEGS1具有81.55%同源性。表达谱分析表明,RhEGS1主要在雄蕊中表达,且在花盛开期表达最强,而在花蕾期及凋谢期表达较弱。原核表达分析发现,在37℃、0.5 mmol.L-1IPTG诱导4 h后,携带RhEGS1 ORF的原核表达载体在大肠杆菌中生成了大量的分子量约为35 kD的蛋白质,其分子量大小与预测的理论值相一致。【结论】从月季雄蕊中克隆到丁香酚合成酶基因RhEGS1,具有EGS基因的结构特征和完整的编码框,且在盛开期雄蕊中表达量最高。

关键词：月季丁香酚合成酶基因 RT-PCR gateway克隆原核表达

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GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

西北植物学报 2010年第6期30卷 1099-1104页

作者：常丽赵小英郭明林建中李秀山刘选明湖南大学生命科学与技术研究院长沙410082

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过gateway克隆技术构建原核重组表达载体pD-EST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化。结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h。蛋... 详细信息

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过gateway克隆技术构建原核重组表达载体pD-EST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化。结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h。蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致。重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白。研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础。

关键词： GA2ox1基因 gateway克隆原核表达纯化 Western Blot

新模式植物短柄二叶草SGT1和RAR1基因沉默和蛋白纯化载体构建

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植物遗传资源学报 2011年第1期12卷 138-144页

作者：张岳平瞿华香中南大学研究生院隆平分院长沙410125 湖南农业大学农学院长沙410128

短柄二叶草作为一种新型的模式植物,已成为当前研究热点。其具有基因组小、生长周期短、生存环境简单和容易人工转化等重要生理和遗传特性,被认为是一种潜力巨大的人类研究能源和粮食作物的重要模式植物。SGT1和RAR1基因是高度保守的并... 详细信息

短柄二叶草作为一种新型的模式植物,已成为当前研究热点。其具有基因组小、生长周期短、生存环境简单和容易人工转化等重要生理和遗传特性,被认为是一种潜力巨大的人类研究能源和粮食作物的重要模式植物。SGT1和RAR1基因是高度保守的并与植物抗病功能紧密相关的重要基因。本文采用gateway克隆技术构建了SGT1和RAR1的基因沉默表达载体。阳性克隆载体经PCR、酶切和测序鉴定。为进一步研究SGT1和RAR1互作蛋白及其功能,采用该克隆技术将基因cDNA全长克隆至串联亲和纯化蛋白表达载体pEarleyGate205中,为纯化SGT1和RAR1及其互作蛋白提供了基础。正确的阳性克隆载体经农杆菌介导转化至短柄二叶草Bd21获得转化株,以期进一步研究SGT1和RAR1基因及蛋白互作对于短柄二叶草抗病功能的影响。

关键词：短柄二叶草 SGT1和RAR1 基因沉默 gateway克隆串联亲和纯化

长春花萜类吲哚生物碱生物合成途径中重要酶(DXR、SLS、G10H、STR)基因的克隆与表达

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植物研究 2007年第5期27卷 564-568页

作者：韩梅赵博安志刚 Thomas Rausch 祖元刚东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室哈尔滨150040 海德堡大学植物学研究所

以分离提取的2周龄长春花植物幼苗总RNA为模板,经两步gateway-PCR反应扩增得到长春花萜类吲哚生物碱合成途径中编码重要酶:5—磷酸脱氧木酮糖还原酶(DXR)、次番木鳖苷合成酶(SLS)、=牛儿醇-10羟化酶(G10H)和异胡豆苷合成酶(STR)的cDNA... 详细信息

以分离提取的2周龄长春花植物幼苗总RNA为模板,经两步gateway-PCR反应扩增得到长春花萜类吲哚生物碱合成途径中编码重要酶:5—磷酸脱氧木酮糖还原酶(DXR)、次番木鳖苷合成酶(SLS)、=牛儿醇-10羟化酶(G10H)和异胡豆苷合成酶(STR)的cDNA基因片段。利用BP重组酶将扩增片段克隆到gateway化的入门载体pDONR201中,并进行测序验证。测序后的基因通过LR重组酶的作用转移到带有HIS标签的目标载体pETG10A中,构成重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达,通过N i-TED树脂纯化方法得到了高纯度的蛋白。

关键词：长春花萜类吲哚生物碱生物合成途径 gateway克隆

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金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达

生命科学研究 2013年第3期17卷 230-237页

作者：李磊杨远柱刘泓杜长青林建中朱咏华刘选明湖南大学生物学院中国湖南长沙410082 湖南亚华种业科学研究院中国湖南长沙410001 福建农林大学资源与环境学院中国福建福州350002

利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.

关键词： FvGDH gateway克隆原核表达 SDS-PAGE Western blotting

利用GFP-Trap技术筛选与TaTLP1相互作用的蛋白

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河北农业大学学报 2020年第2期43卷 76-82页

作者：王菲杨毅清武文月崔钟池王海燕刘大群河北农业大学植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心河北保定071000 中国农业科学院研究生院北京100081

小麦类甜蛋白基因TaTLP1,在植物抗病防御反应中起重要作用。为筛选与TaTLP1相互作用的蛋白,本研究拟通过gateway定向克隆技术构建带有GFP标签的重组载体TaTLP1-pEarleyGate103,在烟草中完成异源表达。利用GFP-Trap技术获得与TaTLP1互作... 详细信息

小麦类甜蛋白基因TaTLP1,在植物抗病防御反应中起重要作用。为筛选与TaTLP1相互作用的蛋白,本研究拟通过gateway定向克隆技术构建带有GFP标签的重组载体TaTLP1-pEarleyGate103,在烟草中完成异源表达。利用GFP-Trap技术获得与TaTLP1互作的蛋白,质谱分析明确其种类。通过Western blot检测TaTLP1表达情况,以GFP抗体检测,膜上曝光结果显示,在约44 kD处出现条带,证明TaTLP1蛋白在烟草中成功表达;质谱分析GFP-Trap获得的洗脱蛋白,表明获得的候选互作蛋白中定位于胞外的病程相关蛋白1(Pathogenesisrelated protein 1, PR1)、非特异性脂质转移蛋白(Non-specific lipid-transfer protein, nsLTPs)等可能与TaTLP1存在互作。该试验为探索TaTLP1参与小麦抗叶锈病基因Lr19的防御反应机制奠定了理论基础。

关键词：小麦叶锈病 gateway克隆 GFP-Trap 蛋白互作

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甘蔗蔗糖磷酸合成酶家族基因演化和功能研究

甘蔗蔗糖磷酸合成酶家族基因演化和功能研究

作者：陈兰平福建师范大学

学位级别：硕士

甘蔗是重要的大型多年生糖料作物,其抗逆性、糖含量和生物量相关分子机制研究一直是甘蔗基础研究中的热点。甘蔗磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS;EC 2.***.1.14)是高等植物中糖分代谢中的重要调控基因,控制植物体内蔗糖的生成,... 详细信息

甘蔗是重要的大型多年生糖料作物,其抗逆性、糖含量和生物量相关分子机制研究一直是甘蔗基础研究中的热点。甘蔗磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS;EC 2.***.1.14)是高等植物中糖分代谢中的重要调控基因,控制植物体内蔗糖的生成,SPS的活性高低直接反映植物体内合成蔗糖的的高低。但是由于甘蔗基因组的高度复杂性,使其基因组测序依然无法在短期内开始启动。近年,甘蔗近源物种高粱基因组测序的完成,且甘蔗有丰富SUCEST数据库,这使应用比较基因组手段鉴定甘蔗蔗糖磷酸合成酶家族基因成为可能。基于比较基因组学和二代测序技术平台上,对甘蔗主要种间糖分代谢基因进化关系的比较分析,旨在揭示不同甘蔗种中糖分代谢关键酶SPS光暗磷酸化调控机制。主要研究内容如下：(1)本研究通过与拟南芥、高粱、水稻等植物的比较基因组研究分析,对含有来自SPS家族基因的热带种及割手密种的14个BAC序列进行鉴定,并进一步进行基因组结构和功能注释。结果发现在热带种和割手密种中均含有5个SPS基因,根据甘蔗近源物种分别命名为SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1、SPSD2.对SPS的进化分析发现,SPSD家族基因为单子叶特异性基因,推测SPSA为SPSD家族基因祖先。(2)结合基于RNA-seq的EST测序和实验验证,通过同源克隆的方法,对甘蔗蔗糖磷酸合成酶进行片段化克隆,分析SPS单倍型和SNP。通过RNA-seq分析发现SPSB在蔗糖合成中发挥重要的作用,而SPSA在蔗糖积累中有重要作用,在胁迫处理条件下,SPSD2取代SPSB发挥蔗糖合成功能,该结论需进一步采用实时荧光定量PCR进行实验验证。(3)以注释甘蔗SPS基因模型序列为模板,采用gateway克隆技术,对甘蔗SPS家族基因全长cDNA进行同源克隆,瞬时转染烟草,获得其亚细胞定位为细胞膜。(4)对拟南芥转基因进行不同光暗胁迫处理,对SPS酶活和植物体内碳水化合物进行测定,解析甘蔗SPS光暗磷酸化机制,Ser-153是SPSD2家族光暗磷酸化位点。

关键词：甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因组结构 gateway克隆光暗磷酸化

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分裂泛素化酵母双杂研究光合膜蛋白相互作用

分裂泛素化酵母双杂研究光合膜蛋白相互作用

作者：朱树勇兰州大学

学位级别：硕士

光合类囊体膜主要由光系统Ⅱ、细胞色素bf复合物、光系统Ⅰ以及ATP合酶四个超分子复合物组成。为进行光合作用功能基因组学研究,采用分裂泛素化酵母双杂交技术从拟南芥叶片cDNA文库中筛选互作蛋白,以期发现参与光系统Ⅱ组装和功能调控... 详细信息

光合类囊体膜主要由光系统Ⅱ、细胞色素bf复合物、光系统Ⅰ以及ATP合酶四个超分子复合物组成。为进行光合作用功能基因组学研究,采用分裂泛素化酵母双杂交技术从拟南芥叶片cDNA文库中筛选互作蛋白,以期发现参与光系统Ⅱ组装和功能调控的蛋白因子。本论文为实现这一设想作了一些尝试: 1.利用分裂泛素化酵母双杂交系统研究光合类囊体膜蛋白间的相互作用。将叶绿体psbA基因编码的D1蛋白作为诱饵蛋白,以叶绿体基因psbD编码的D2蛋白、petB编码的Cytb蛋白作为靶蛋白,分别共转化酵母菌株后进行相互作用分析。实验结果表明,诱饵蛋白D1能与来源于同一复合物光系统Ⅱ的D2蛋白发生相互作用,而与来源于细胞色素bf复合物的Cytb蛋白没有互作。这一结果表明,分裂泛素化酵母双杂交系统可以用于检测光合膜蛋白间的相互作用,从而为研究光合膜蛋白生物发生的调控机理提供一个有效的工具。 2.采用gateway克隆技术构建拟南芥叶片cDNA入门文库(entry library)以attB2-Oligod(T)反转录合成cDNA第一链,在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链后,在其5’端引入attB1位点以进行BP重组反应。以反应产物电转化大肠杆菌DH10B。对文库进行质量分析显示该文库代表性为0.97×10,平均插入片段长度684bp,插入片段长度范围500-950bp。

关键词：光合膜蛋白酵母双杂交蛋白质相互作用分裂泛素 gateway克隆 cDNA文库

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靶向肿瘤细胞的腺病毒纤毛蛋白改造研究

靶向肿瘤细胞的腺病毒纤毛蛋白改造研究

作者：陈亚龙浙江理工大学

学位级别：硕士

腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)以其宿主范围广、转导效率高、插入外源基因片段大、不整合到细胞基因组上和安全性较高等原因,在肿瘤的基因治疗中作为基因转移载体被广泛应用。目前对腺病毒的分子生物学特性研究得最为详细的是人腺... 详细信息

腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)以其宿主范围广、转导效率高、插入外源基因片段大、不整合到细胞基因组上和安全性较高等原因,在肿瘤的基因治疗中作为基因转移载体被广泛应用。目前对腺病毒的分子生物学特性研究得最为详细的是人腺病毒血清2型(Ad2)和人腺病毒血清5型(Ad5),其中由于C族5型腺病毒(Ad5)的生物学和遗传学特性研究的最为彻底,因此作为基因传递载体在基因治疗中应用的最为广泛。腺病毒的衣壳蛋白是决定腺病毒感染嗜性的最主要因素,尤其是其纤毛蛋白头部(fiber knob)CAR结合域和五邻体基底的5个多肽分子中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。为增加腺病毒的感染靶向性,科学家们已经尝试在五邻体基底部和纤维蛋白头部的HI环等部位插入RGD序列、特异配体或多聚赖氨酸序列等手段,从而可以特异性地与某些组织、细胞表面的受体结合。然而,这些手段固然能够扩大Ad的感染嗜性,但仍不能降低其对非靶细胞的天然嗜性,尤其是对肝脏的毒性作用[1][2]。条件增殖型腺病毒(Conditionally replicative adenovirus,CRAd)又称肿瘤特异性腺病毒(tumor pecific adenovirus)。其特点是复制增殖能力被选择性的保留,在正常组织的细胞里复制能力被大大削弱或不能复制,而在肿瘤细胞内却可以表现出较强的增殖能力,从而在保证溶瘤腺病毒在利用自身的增殖杀灭肿瘤细胞的同时,不对正常细胞产生明显的毒副作用,因而具备了肿瘤靶向性和用药安全性。腺病毒是通过其纤毛吸附到宿主细胞并与细胞表面受体结合,进而感染宿主细胞的。从理论上,溶瘤病毒可在肿瘤细胞中大量增殖,释放出的病毒又可以感染周围的肿瘤细胞,最终通过级联放大效益消除整个肿瘤瘤块。然而体内外的实验表明,溶瘤病毒并不能完全杀伤肿瘤细胞,国际上一直认为是肿瘤内部正常细胞或坏死组织间隔所致。然而最近有研究表明其主要原因是在腺病毒颗粒包装过程中,腺病毒的纤毛蛋白是过量表达的,腺病毒腺病毒纤毛蛋白的过度表达的功能目前还不是很清楚,但一般被认为对腺病毒颗粒的包装是非常重要的。然而这些过度生产的游离纤毛蛋白有可能会先一步与未感染的肿瘤细胞表面的受体结合,进而屏蔽掉细胞表面的受体,使释放出的子代病毒不能有效感染周围的肿瘤细胞,阻断病毒对肿瘤细胞的二次感染。(范小龙教授文章in press),本课题通过Western Blot及RT-PCR基本证实了这一论点,基于以上论点,本课题拟从Fiber入手,对腺病毒的纤毛蛋白进行修饰,然而传统的腺病毒改造方法较为繁琐且难以操作,故本研究中我们建立了成熟的gateway重组系统,使腺病毒的fiber改造变得更易于操作,并且fiber后插入的红色荧光蛋白在荧光显微镜下观察成功变红,说明我们建立的gateway重组系统是成功的。本研究中为增加腺病毒的二次感染率,我们在腺病毒的fiber后面加上MicroRNA21, MicroRNA155肿瘤特异性靶位点以下调fiber的表达,并利用gateway克隆技术将进行修饰过的Fiber直接重组到含有去除野生型fiber的全长腺病毒的载体中,将该载体包装的病毒直接转染293细胞和其它肝癌细胞,希望可以筛选出对肿瘤细胞具有高亲和力和高杀伤能力的腺病毒载体。目前已成功构建了一系列的fiber后带MicroRNA的腺病毒载体,并成功包装好病毒。并对其靶向性和杀伤力的效果进行了初步研究。

关键词：溶瘤腺病毒 MicroRNA gateway克隆外壳改造