靶向肿瘤细胞的腺病毒纤毛蛋白改造研究

作     者：陈亚龙 

作者单位：浙江理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钱其军

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：溶瘤腺病毒 MicroRNA Gateway克隆 外壳改造 

摘      要：腺病毒载体(Adenovirus vector,Adv)以其宿主范围广、转导效率高、插入外源基因片段大、不整合到细胞基因组上和安全性较高等原因,在肿瘤的基因治疗中作为基因转移载体被广泛应用。目前对腺病毒的分子生物学特性研究得最为详细的是人腺病毒血清2型(Ad2)和人腺病毒血清5型(Ad5),其中由于C族5型腺病毒(Ad5)的生物学和遗传学特性研究的最为彻底,因此作为基因传递载体在基因治疗中应用的最为广泛。 腺病毒的衣壳蛋白是决定腺病毒感染嗜性的最主要因素,尤其是其纤毛蛋白头部(fiber knob)CAR结合域和五邻体基底的5个多肽分子中的Arg-Gly-Asp(RGD)基序。为增加腺病毒的感染靶向性,科学家们已经尝试在五邻体基底部和纤维蛋白头部的HI环等部位插入RGD序列、特异配体或多聚赖氨酸序列等手段,从而可以特异性地与某些组织、细胞表面的受体结合。然而,这些手段固然能够扩大Ad的感染嗜性,但仍不能降低其对非靶细胞的天然嗜性,尤其是对肝脏的毒性作用[1][2]。 条件增殖型腺病毒(Conditionally replicative adenovirus,CRAd)又称肿瘤特异性腺病毒(tumor pecific adenovirus)。其特点是复制增殖能力被选择性的保留,在正常组织的细胞里复制能力被大大削弱或不能复制,而在肿瘤细胞内却可以表现出较强的增殖能力,从而在保证溶瘤腺病毒在利用自身的增殖杀灭肿瘤细胞的同时,不对正常细胞产生明显的毒副作用,因而具备了肿瘤靶向性和用药安全性。 腺病毒是通过其纤毛吸附到宿主细胞并与细胞表面受体结合,进而感染宿主细胞的。从理论上,溶瘤病毒可在肿瘤细胞中大量增殖,释放出的病毒又可以感染周围的肿瘤细胞,最终通过级联放大效益消除整个肿瘤瘤块。然而体内外的实验表明,溶瘤病毒并不能完全杀伤肿瘤细胞,国际上一直认为是肿瘤内部正常细胞或坏死组织间隔所致。然而最近有研究表明其主要原因是在腺病毒颗粒包装过程中,腺病毒的纤毛蛋白是过量表达的,腺病毒腺病毒纤毛蛋白的过度表达的功能目前还不是很清楚,但一般被认为对腺病毒颗粒的包装是非常重要的。然而这些过度生产的游离纤毛蛋白有可能会先一步与未感染的肿瘤细胞表面的受体结合,进而屏蔽掉细胞表面的受体,使释放出的子代病毒不能有效感染周围的肿瘤细胞,阻断病毒对肿瘤细胞的二次感染。(范小龙教授文章in press),本课题通过Western Blot及RT-PCR基本证实了这一论点, 基于以上论点,本课题拟从Fiber入手,对腺病毒的纤毛蛋白进行修饰,然而传统的腺病毒改造方法较为繁琐且难以操作,故本研究中我们建立了成熟的Gateway重组系统,使腺病毒的fiber改造变得更易于操作,并且fiber后插入的红色荧光蛋白在荧光显微镜下观察成功变红,说明我们建立的Gateway重组系统是成功的。本研究中为增加腺病毒的二次感染率,我们在腺病毒的fiber后面加上MicroRNA21, MicroRNA155肿瘤特异性靶位点以下调fiber的表达,并利用Gateway克隆技术将进行修饰过的Fiber直接重组到含有去除野生型fiber的全长腺病毒的载体中,将该载体包装的病毒直接转染293细胞和其它肝癌细胞,希望可以筛选出对肿瘤细胞具有高亲和力和高杀伤能力的腺病毒载体。目前已成功构建了一系列的fiber后带MicroRNA的腺病毒载体,并成功包装好病毒。并对其靶向性和杀伤力的效果进行了初步研究。