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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2011年第5期29卷 363-367页

作者：郑斌尹志奎何蔼李卓雅詹希美新乡医学院寄生虫学教研室新乡453000 中山大学中山医学院寄生虫学教研室广州510080 新乡医学院药学院新乡453000

目的通过gst沉降技术(gst pull-down)验证刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)与肌动蛋白(actin)的相互作用。方法 PCR扩增弓形虫cDNA中aldolase和actin基因,分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1和pET30a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析法纯化表达产物。采用腹部皮内多点注射免疫SD大鼠15只,首次免疫Actin-His6蛋白量为200μg/只,第2次起免疫蛋白量为100μg/只,共免疫4次,每次间隔7 d,末次免疫后5 d收集心脏血,制备Actin-His6抗血清。以纯化的gst-Aldolase蛋白作为探针蛋白与Actin-His6蛋白液进行gst沉降实验,实验产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果获得了弓形虫aldolase和actin基因序列,构建了相应的原核表达载体。表达并纯化了gst-Aldolase和Actin-His6蛋白。Actin-His6蛋白免疫SD大鼠后获得其抗血清,经抗体亲和纯化柱纯化,获得Actin-His6多克隆抗体。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,gst沉降实验产物中的蛋白条带可被Aldolase-His6多克隆抗体和Actin-His6多克隆抗体识别。结论弓形虫醛缩酶与肌动蛋白存在相互作用。

关键词：刚地弓形虫醛缩酶肌动蛋白 gst沉降技术蛋白相互作用

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弓形虫MIC6突变体的构建及其特性分析

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生物技术 2014年第3期24卷 50-52页

作者：尹志奎赵林静郑斌詹希美新乡医学院药理学教研室河南新乡453000 新乡医学院寄生虫学教研室河南新乡453000 中山大学中山医学院寄生虫学教研室广东广州510089

目的:体外构建弓形虫微线体蛋白6(MIC6)突变体并分析其特性。方法:利用基因定点突变的方法,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)的348位色氨酸的碱基突变为缬氨酸的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段;构建MIC6C W/V/pGEX-4T-1重组原核表达系统,I... 详细信息

目的:体外构建弓形虫微线体蛋白6(MIC6)突变体并分析其特性。方法:利用基因定点突变的方法,将MIC6蛋白羧基端(MIC6C)的348位色氨酸的碱基突变为缬氨酸的碱基,PCR扩增MIC6C W/V突变体基因片段;构建MIC6C W/V/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达gst-MIC6C W/V突变体蛋白。以该蛋白为探针蛋白与弓形虫裂解液进行gst沉降实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果:获得了MIC6C W/V突变体基因片段,制备了gst-MIC6C W/V突变体蛋白;MIC6C W/V突变体蛋白的沉降产物中未见蛋白条带,而MIC6C蛋白(未突变蛋白)的产物中有一蛋白条带,且能被抗醛缩酶抗体识别。结论:在体外获得了MIC6突变体;MIC6突变体失去了与醛缩酶作用的特性。

关键词：刚地弓形虫微线体蛋白6 点突变突变体 gst沉降技术

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拟南芥AT14A蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

拟南芥AT14A蛋白相互作用蛋白的筛选与验证

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作者：孙勤富扬州大学

学位级别：硕士

拟南芥AT14A蛋白是DUF677蛋白超家族成员。针对该蛋白家族的研究很少,其成员的具体功能鲜有报道。序列分析发现AT14A蛋白有一个小的结构域与动物整合素存在序列相似性,因此推断其可能为一种功能与动物整合素相似的蛋白,即类整合素蛋白... 详细信息

拟南芥AT14A蛋白是DUF677蛋白超家族成员。针对该蛋白家族的研究很少,其成员的具体功能鲜有报道。序列分析发现AT14A蛋白有一个小的结构域与动物整合素存在序列相似性,因此推断其可能为一种功能与动物整合素相似的蛋白,即类整合素蛋白。整合素在动物细胞粘附、运动、分裂、增殖和分化等多个生理进程中具有重要功能。针对AT14A蛋白已有的研究表明,该蛋白是一种膜蛋白,在悬浮细胞的形状维持、细胞骨架的组织中发挥作用,并且可能参与细胞壁的构成,但AT14A蛋白发挥功能的分子基础还未可知。本研究通过酵母双杂交、免疫共沉淀、gst沉降等技术对AT14A的相互作用蛋白进行筛选和验证,并利用RT-qPCR技术检验互作蛋白在AT14A相关基因型幼苗中的mRNA表达水平,探究AT14A蛋白的分子生物学功能,以期为进一步阐明AT14A蛋白的功能提供依据。主要结果如下：(1)通过酵母GAL4双杂交系统技术利用构建的AT14A-N与AT14A-C'‘诱饵”质粒在拟南芥cDNA表达文库中筛选共得到了134个阳性酵母克隆。在测序后得到的37个与AT14A胞内结构域相互作用的候选蛋白编码基因中,用AT14A-N筛选到19个,用AT14A-C筛选到了18个。这些基因编码的蛋白中,有9个功能未知;其中10基因有2-3个克隆。另有一个基因同时被两个“诱饵”筛选到。(2)从两次筛选得到的候选互作蛋白中各选择5个,分别为：ATSYP23,ATSNX1, CIP1, AtFH7, CSN4, Sec14p-like phosphatidylinositol transfer family protein, ATVDAC3, ATSYTA, EDM1,ARA4。将这些重组质粒直接转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,成功进行了原核表达;同时表达了两个“诱饵”蛋白,并采用Co-IP技术体外验证其互作的真实性。结果显示这些蛋白中只有AtFH7与EDM1分别与AT14A的N端和C端结构域体外互作。(3)构建了原核表达载体pGEX/AT14A,转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),探索了gst-AT14A蛋白的可溶性表达条件,并分别与AtFH7与EDM1的Y2H重组质粒表达蛋白进行了gst-pull down体外互作验证。结果显示两者之间没有体外相互作用。(4)用RT-qPCR测定了野生型、at14α-1缺失突变体与AT14A过表达植株中各可能互作蛋白的表达情况,发现AtFH7、EDM1两种基因的mRNA表达水平在过表达植株中有显著升高,但在缺失突变体中没有显著变化。本研究通过AT14A互作蛋白的筛选验证,证明了AtFH7和EDM1蛋白与AT14A蛋白胞内结构域存在相互作用,为AT14A蛋白的分子生物学功能研究奠定了基础。

关键词： AT14A 类整合素蛋白相互作用酵母双杂交免疫共沉淀 gst沉降技术

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