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人类免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白(Gag)在大肠杆菌中的表达

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中国生物制品学杂志 2005年第3期18卷 209-211页

作者：王杨褚嘉祐周东霞孙明黄小琴俞建昆中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所昆明650118

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SD... 详细信息

目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型核心蛋白Gag,为HIV感染的诊断和疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增获得HIV1gag基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX5X1的tac启动子下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,以SDSPAGE和Westernblot分析验证其表达产物。结果表达产物是相对分子质量为82000的gst融合蛋白,且能与抗p24单克隆抗体发生特异性反应。结论重组Gag蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达,且具有良好的抗原性,可进一步用于HIV感染及动物免疫等方面的研究。

关键词：大肠杆菌人类免疫缺陷病毒核心蛋白亚型 1型 SDS-PAGE 人免疫缺陷病毒 Western gst融合蛋白原核表达载体重组表达质粒 blot分析相对分子质量表达产物 PCR扩增单克隆抗体 Gag蛋白基因片段诱导表达动物免疫 HIV

淋病奈瑟菌PI蛋白基因的构建、表达及其粘附抑制作用研究

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淋病奈瑟菌PI蛋白基因的构建、表达及其粘附抑制作用研究

作者：岑建萍浙江大学

学位级别：硕士

近年来，我国性传播性疾病的发病率持续快速升高已严重危害我国人民的健康和家庭幸福。淋病是由淋病奈瑟菌感染引起的世界上发病率最高的性传播疾病之一。随着淋球菌耐药菌株不断增加，抗菌治疗日益困难。探讨淋球菌的致病机理，找到理... 详细信息

近年来，我国性传播性疾病的发病率持续快速升高已严重危害我国人民的健康和家庭幸福。淋病是由淋病奈瑟菌感染引起的世界上发病率最高的性传播疾病之一。随着淋球菌耐药菌株不断增加，抗菌治疗日益困难。探讨淋球菌的致病机理，找到理想的淋病治疗和预防手段已成为我国迫在眉捷的大事。据大量文献报道，淋病奈瑟菌进入机体后首先需粘附于泌尿生殖道上皮细胞表面，然后才能进入机体引起一系列病变，粘附是淋球菌致病的先决条件，一旦失去粘附能力，就不能引起淋病。进一步研究发现，淋球菌的外膜蛋白在细菌粘附中起了至关重要的作用。淋球菌的外膜蛋白不仅与淋球菌致病机制有关，而且也可能是淋病疫苗的潜在免疫原。目前已知的淋球菌表面抗原有多种，其中Porin I(PI)是外膜蛋白中含量最高的蛋白成分，约占60％，仅有中等程度的抗原变异，且抗PI抗体具有杀菌作用，因而PI抗原理论上最有可能用于制备成功的淋病疫苗。我们成功地构建、表达并纯化了淋球菌外膜gst-PI融合蛋白，经鉴定证实该蛋白为淋球菌外膜PI蛋白特异性的，并初步进行了淋球菌粘附抑制试验，以观察家兔多价抗血清对淋球菌粘附上皮细胞过程的抑制作用。现将研究过程和结果报道如下。方法 2002年浙江大学医学院硕士论文（一人重组体的构建二、聚合萌链反应（PCR）及其产物的回收：淋球菌外膜PI蛋白基因用PCR扩增。上游引物5’－－rH TCC ATG AAA AAA TCC CTG ATT GCC CTG－3’;下游引物 5’－CT’r AAG CTT AAA CAC hC GTC TGG CTG TGG－3’。PCR产物用 glass milk kit回收。 2、连接和转化：将回收的PCR产物插入克隆载体T－Easy－Vector形成克隆重组体（T－Easy－－Vector／PI）。测序鉴定后，将PI蛋白基因插入表达载体pGEX－4T－2 形成表达重组体（PGEX－4T－2／PI）。（二L朋卜PI＄合蛋白的诱导及纯化： gst－PI融合蛋白的诱导主要按gst基因融合系统试剂盒说明书进行。 gst－PI融合蛋白可溶性分析显示该蛋白为非可溶性，故用SDS－－PAGE电泳、切下融合蛋白条带、电洗脱回收等方法提纯。（三人重组蛋白的鉴定：纯化回收的融合蛋白用斑点免疫层析试验鉴定。制备胶体金标记的滤纸条，加一滴去离子水，5分钟后硝酸纤维素膜上出现一条紫红色条带，表示该蛋白与PI蛋白单克隆抗体发生特异性结合。（四人淋球菌粘附抑制试验：淋球菌粘附抑制试验：单克隆淋球菌斑分别重悬于lml DME比家兔抗血清 0．5。l和 DMEM ***的混合液、家兔抗血清 0．25ml和 DMEM 0．75ml 混合液中（上述DMEM不含抗生素）。淋球菌与抗血清先共同孵育半小时。然后淋球茵与Heha细胞共同孵育3 ，J’时。弃培养液，用DMEM洗2次。革兰氏染色，高倍油镜下观察结果。结果与结论 3 2002年浙江大学医学院硕士论文 1、淋病奈瑟菌外膜PI蛋白基因的鉴定：我们克隆的淋病奈瑟氏菌外膜PI蛋白基因长度为约Ikb，将其测序结果同PUbMed基因库中淋球菌外膜PI蛋白基因序列对照后，确定其序列与 GI“3925491”［GenBank］Neisseria gonorrhoeae相一致。 2、融合蛋白的诱导表达、可溶性分析及纯化：我们将含表达重组体的大肠杆菌诱导前、诱导后的产物用 10AsDS－－PAGE进行凝胶电泳，考马斯亮蓝染色后观察发现：在分子量为约 60 000处，诱导后的大肠杆菌可见浓染条带，而诱导前的大肠杆菌则无浓染条带。这表明我们诱导出的 gst－－PI融合蛋白的实际分子量为约 60 000。

关键词：淋病奈瑟菌外膜蛋白 gst融合蛋白

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重组FAS分子的表达、纯化及抗体制备

中国生物化学与分子生物学报 1999年第2期15卷 200-204页

作者：罗振革孔祥英彭虹张明高杰英军事医学科学院微生物流行病研究所

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，经ＤＮＡ序列测定后，再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间，构成重组质粒ｐＫＧ... 详细信息

用ＰＣＲ法扩增出编码人ＦＡＳ分子胞外区的ｃＤＮＡ片段，直接克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，经ＤＮＡ序列测定后，再插入到谷胱甘肽转硫酶（ＧＳＴ）融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－ＫＧ的ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ位点之间，构成重组质粒ｐＫＧ－ｈＦＡＳ，将此质粒导入大肠杆菌，经ＩＰＴＧ诱导后获得ＧＳＴ－ｈＦＡＳ重组融合蛋白的表达，用谷胱甘肽偶联的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ经亲合层析获得纯化的ＧＳＴ－ｈＦＡＳ蛋白，经凝血酶酶切和二次亲合层析去除ＧＳＴ部分，得到纯化的ＦＡＳ蛋白．用纯化的ＦＡＳ抗原免疫家兔制备了抗ＦＡＳ抗体。

关键词： FAS分子 gst融合蛋白亲合层析纯化抗体重组

蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒腺cDNA文库抗菌肽基因筛选及表达

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蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum毒腺cDNA文库抗菌肽基因筛选及表达

作者：吴珏婧浙江大学

学位级别：硕士

昆虫抗菌肽是昆虫对入侵病原微生物免疫应答反映的效应物,当受到微生物侵染时,其脂肪体和血细胞等中会产生一类小分子物质,并迅速释放到血淋巴中抵抗微生物入侵。它们大多是阳离子肽,分子量小,有广泛的杀菌谱,对细菌等病原菌、甚至肿瘤... 详细信息

昆虫抗菌肽是昆虫对入侵病原微生物免疫应答反映的效应物,当受到微生物侵染时,其脂肪体和血细胞等中会产生一类小分子物质,并迅速释放到血淋巴中抵抗微生物入侵。它们大多是阳离子肽,分子量小,有广泛的杀菌谱,对细菌等病原菌、甚至肿瘤细胞和病毒也有抑杀作用,有望发展成为新一代肽类抗生素。目前,在鳞翅目、双翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目和等翅目中发现200多种昆虫抗菌肽,而金小蜂体内抗菌物质的研究几近空白。本文以蝶蛹金小蜂毒腺为材料,构建了cDNA文库,对抗菌肽基因进行筛选,克隆到了新型抗菌肽基因,并将其在不同原核表达系统中表达,初步测定其抑菌活性。结果如下:1.以蝶蛹金小蜂Ptermalus puparum毒腺为材料,构建了毒腺cDNA文库。通过X-gal显色原理测定蓝白斑数量,文库的重组率为97.6%。对原始文库进行滴度检测,结果为8.95×10～4pfu/ml,扩增后的滴度为3.1×10～7pfu/ml。对随机挑选的噬菌斑进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳下显示外源插入cDNA片段大小在0.3～1.6kb之间。文库质量鉴定结果表明,此文库具有较好的库容量、较高的重组率及较大的插入片段。2.采用基于cDNA表达文库的昆虫源抗菌肽基因的高效克隆筛选技术。对上述文库大批量的筛选和重复涂板验证后,得到3个有一定抑菌效果的阳性克隆。对其进行核苷酸测序,得到的核苷酸序列用BLASTn软件在GenBank非冗余核苷酸数据库和AMP数据库进行比对,没有发现同源性很高的序列,推断所得克隆是新型抗菌肽基因。3.将含信号肽序列的PP2a和不含信号肽的PP2b基因在两种大肠杆菌表达系统pET28a/BL21和pGEX-4T-2/BL21中进行表达。在pET28a/BL21系统中,获得了高效表达的融合蛋白His-PP2a;在pGEX-4T-2/BL21系统中,获得了高效表达的融合蛋白gst-PP2b和主要以包涵体形式存在的gst-PP2a。并用抗His抗体和抗gst抗体的Western印迹分析证实了上述融合蛋白的表达。对这些蛋白粗提液进行初步抑菌活性测定,均具有一定抑菌作用,尤其以gst-PP2b抑菌效果最好。

关键词：蝶蛹金小蜂毒腺 cDNA文库抗菌肽筛选克隆融合表达 His融合蛋白 gst融合蛋白活性测定

马蔺(Iris lactea)液泡型H^+-ATP酶c亚基蛋白的原核表达与纯化

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基因组学与应用生物学 2014年第6期33卷 1324-1328页

作者：周爱民马婧林关佳琦王金刚车代弟柳参奎东北油田盐碱植被与恢复教育部重点实验室东北林业大学盐碱地生物环境研究中心哈尔滨150040 东北农业大学园艺学院哈尔滨150030

液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)是植物生长、发育及应对逆境胁迫的关键酶,全酶由13种不同亚基组成,而V-ATPase c亚基(VHA-c)是分子量为16 k D的高度保守的脂质蛋白,对V-ATPase全酶的组装和活性具有重要作用。本研究中,利用RT-PCR方法从马蔺(I... 详细信息

液泡型H+-ATP酶(V-ATPase)是植物生长、发育及应对逆境胁迫的关键酶,全酶由13种不同亚基组成,而V-ATPase c亚基(VHA-c)是分子量为16 k D的高度保守的脂质蛋白,对V-ATPase全酶的组装和活性具有重要作用。本研究中,利用RT-PCR方法从马蔺(Iris lactea)中克隆出Irl VHA-c基因全长读码框,将其构建到原核表达载体pGEX上并在大肠杆菌BL21中诱导表达。结果发现在0.1 mmol/L的IPTG终浓度下诱导8hgst-IrlVHA-c融合蛋白高效表达,并利用层析方法纯化获得了gst-IrlVHA-c融合蛋白,进一步为研究IrlVHA-c蛋白的结构与功能提供帮助。

关键词：马蔺(Iris lactea) V-ATP酶 c亚基原核表达 gst融合蛋白

蛋白酪氨酸磷酸酶1B抑制剂高通量筛选模型建立和应用

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天然产物研究与开发 2005年第5期17卷 606-609页

作者：罗弟祥何耀高小平张义正四川大学生命科学学院成都610064 成都地奥制药集团药物研究所成都610041

本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase,PTP1B)作为靶点,采用分子克隆gst融合蛋白的方法,重组表达获得PTP1B,结合自动化操作技术和比色分析,建立了一种PTP1B抑制剂的高通量筛选模型。经在96孔板优化各种反应条件并对17... 详细信息

本文以蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase,PTP1B)作为靶点,采用分子克隆gst融合蛋白的方法,重组表达获得PTP1B,结合自动化操作技术和比色分析,建立了一种PTP1B抑制剂的高通量筛选模型。经在96孔板优化各种反应条件并对17940个样品的筛选结果表明,靶向PTP1B建立的高通量筛选模型具有微量、快速、特异、灵敏等特点,平均日筛选量可达15000样次以上,为寻找新的抗糖尿病药物和先导化合物提供了一种先进的手段。

关键词：蛋白酪氨酸磷酸酶 gst融合蛋白高通量药物筛选植物提取物

乳链菌肽抗性蛋白（NSR）突变体在大肠杆菌中的表达纯化及功能研究

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乳链菌肽抗性蛋白（NSR）突变体在大肠杆菌中的表达纯化及功能研究

作者：刘家乐安徽农业大学

学位级别：硕士

乳链菌肽(Nisin)是某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽,而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein,NSR)的表达则使一些非Nisin产生菌获得Nisin抗性。本实验室前期研究结果表明,作为乳酸乳球菌中第一个被鉴定的末端特异性蛋白酶,NSR是通... 详细信息

乳链菌肽(Nisin)是某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽,而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein,NSR)的表达则使一些非Nisin产生菌获得Nisin抗性。本实验室前期研究结果表明,作为乳酸乳球菌中第一个被鉴定的末端特异性蛋白酶,NSR是通过降解Nisin使其抑菌活性降低来行使Nisin抗性功能的,其降解位点在Nisin分子的MeLan28(Methyllanthionine,甲基羊毛硫氨酸)和Ser29之间。在此研究基础上,本文进一步对NSR蛋白的结构与功能关系,包括其核心功能区降解Nisin活性及与底物Nisin的结合能力等进行了研究,为深入了解和阐明NSR作为一种末端特异性蛋白酶行使Nisin抗性的作用机制奠定基础。本研究首先是确定NSR行使体外降解Nisin功能的核心功能区域。在对NSR蛋白进行同源序列分析以及二级结构、三级结构比对的基础上,构建了不同结构域缺失的NSR与谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase, gst)的融合表达载体NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38,并转化大肠杆菌E. coli BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析显示各表达产物均以部分可溶形式存在。经过谷胱甘肽(GSH)亲和柱层析、PreScission蛋白酶切后最终获得电泳纯的NSR不同结构域缺失突变体蛋白。进而通过体外反应系统,检测了各突变体体外降解Nisin的生物功能。反应产物抑菌活性测定结果表明被NSRΔ38作用后的Nisin丧失了抑菌活性,而被NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67作用后的Nisin没有丧失抑菌活性;反相高效液相层析(RP-HPLC)分析结果进一步表明这是由NSRΔ38具备Nisin降解活性所造成的,而突变体NSR-TSP、NSR△94、NSR△78、NSR△67则不具备Nisin降解活性。为进一步分析NSR不同功能区识别结合底物Nisin的能力,采用相同策略,分别构建了NSR△94、NSR△78、NSR△67、NSR△38第236位丝氨酸突变的截短突变体,并在大肠杆菌中实现了gst融合表达,经过GSH柱层析、PreScission蛋白酶切后获得电泳纯不具降解活性的突变体蛋白。利用表面等离子共振技术(SPR)分别检测了NSRS△27、NSRS△38、NSRS△94突变体在体外对Nisin的结合能力,结果显示NSRS△38、NSRS△94两个突变体结合Nisin的Kd值相同,而NSRS△27结合Nisin的Kd值比NSRS△38及NSRS△94的Kd值高一个数量级,表明了其更强的底物结合能力。

关键词：乳链菌肽抗性蛋白末端特异性蛋白酶 gst融合蛋白表面等离子共振(SPR)

抗菌肽Pexiganan和IB-367基因在大肠杆菌中的克隆与表达

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抗菌肽Pexiganan和IB-367基因在大肠杆菌中的克隆与表达

作者：杨旭天津大学

学位级别：硕士

抗菌肽是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽,是生物先天免疫的重要组成部分,是机体理想的第一道防线。抗菌肽具有分子量小、合成速度快、扩散迅速、强碱性、热稳定性高、水溶性好、抗菌机理独特等特性。抗菌肽具有广谱抗菌能... 详细信息

抗菌肽是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽,是生物先天免疫的重要组成部分,是机体理想的第一道防线。抗菌肽具有分子量小、合成速度快、扩散迅速、强碱性、热稳定性高、水溶性好、抗菌机理独特等特性。抗菌肽具有广谱抗菌能力的同时,甚至对病毒及肿瘤细胞也能发挥杀灭作用,更重要的是抗菌肽对高等动物正常细胞无明显的毒害作用。传统抗生素耐药菌株种类不断增多,全球抗生素的滥用加速了这一过程,抗菌肽的开发将为解决这一棘手难题提供更多的途径。抗菌肽所具备的药用价值使其被开发成为新一类抗感染药物成为可能。本课题通过人工合成两种抗菌肽Pexiganan和IB-367的基因,构建了表达载体并筛选了两株表达抗菌肽的工程菌株,在大肠杆菌中分别表达了Pexiganan和IB-367与gst的融合蛋白,摸索出了融合蛋白以可溶形式大量存在于上清中的最佳诱导条件,并通过亲和层析对表达载上清中的融合蛋白进行纯化,纯化后的产物经过Factor Xa切割得到两种目的小肽——Pexiganan和IB-367。抑菌活性检测证明Pexiganan和IB-367对金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌均有抑制作用。

关键词：抗菌肽基因克隆 Pexiganan IB-367 gst融合蛋白可溶性表达抑菌活性

p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

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中国生物化学与分子生物学报 1999年第1期15卷 27-31页

作者：黄长晖覃林花傅继梁第二军医大学医学分子遗传学军队重点实验室

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响，应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变，并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达... 详细信息

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响，应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变，并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体，在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体，并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．

关键词： p16基因定点突变原核表达 gst融合蛋白