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生物技术 2017年第3期27卷 252-258页

作者：谢亮王琼程小玲彭静王美刘梦雯屈品均辛化伟武汉科技大学生物医学研究院湖北武汉430070

[目的]将改造后的gfp(super-fold gfp,简写为sf gfp)作为三分子荧光互补技术的基础,通过应用多种gfp结合蛋白(gfp binding protein,GBP),筛选并验证可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白。[方法]将sf gfp拆分为三部分(gfp1-9,gfp10和gfp11)... 详细信息

[目的]将改造后的gfp(super-fold gfp,简写为sf gfp)作为三分子荧光互补技术的基础,通过应用多种gfp结合蛋白(gfp binding protein,GBP),筛选并验证可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白。[方法]将sf gfp拆分为三部分(gfp1-9,gfp10和gfp11),建立gfp三分子荧光互补技术体系,利用多种gfp结合蛋白对gfp三分子荧光互补技术进行试验,通过观察荧光变化筛选可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白。[结果]发现DARPin-gfp、gfp-enhancer和Nbsf gfp这三种gfp结合蛋白能够与gfp共定位并对gfp三分子重组装有增强效果,其中gfp-enhancer与Nbsf gfp增强效果约为原荧光强度4倍,DARPin-gfp约为2倍。[结论]gfp结合蛋白可作为一种新手段,使以gfp三分子荧光互补技术为基础的蛋白质-蛋白质相互作用研究的检测效率和灵敏度得到提高。

关键词： super-folder gfp gfp结合蛋白三分子荧光互补技术

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一种通过gfp结合蛋白强化gfp三分子荧光互补作用方法的建立与验证

一种通过GFP结合蛋白强化GFP三分子荧光互补作用方法的建立与验证

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作者：谢亮武汉科技大学

学位级别：硕士

目的:将改造后的gfp（super-fold gfp,简写为sf gfp）作为三分子荧光互补方法的基础,通过应用多种gfp结合蛋白,观察其对荧光互补的影响,筛选并验证可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白,优化gfp三分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的... 详细信息

目的:将改造后的gfp（super-fold gfp,简写为sf gfp）作为三分子荧光互补方法的基础,通过应用多种gfp结合蛋白,观察其对荧光互补的影响,筛选并验证可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白,优化gfp三分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用。方法:1.绿色荧光蛋白筛选:细胞转染实验检测,选取野生型gfp（Egfp）与结构改造后的superfolder gfp（sf gfp）相比下,荧光强度的差异。2.构建我们自己的三分子荧光互补技术体系:将sf gfp拆分为三部分（gfp1-9,gfp10和gfp11）,建立gfp三分子荧光互补作用的实验体系。***结合蛋白的筛选:利用多种gfp结合蛋白在细胞水平对gfp三分子荧光互补作用进行检验,筛选出可强化荧光互补作用的gfp结合蛋白;通过gfp结合蛋白与重组装的gfp共定位,探索gfp结合蛋白是否可以结合到三拆分后重新组装的gfp上去;再通过体外实验对细胞实验结果进行验证;最后通过gfp结合蛋白与gfp的结合实验,发现gfp结合蛋白与gfp的结合位点。4.共聚焦研究gfp重组装的定位能力:以LNMB1为研究对象使用共聚焦显微镜研究重新组装的绿色荧光是否与具有特征性定位的蛋白位置相同。***三分子荧光互补技术的衍生:将三分子互补技术拓展到五分子互补,并进行检验。结果:1:通过细胞实验得出sf gfp比野生型Egfp具有更强的荧光,推断sf gfp更加适合用于研究。2.成功构建gfp三分子荧光互补技术体系,三拆分后的gfp可以通过相互作用的蛋白牵引,重新组装得到绿色荧光。3.发现了三种gfp结合蛋白,DARPin-gfp、gfp-enhancer和Nbsf gfp能够在细胞中对三拆分后的gfp重组起到2-4倍的加强效果;gfp结合蛋白与gfp可共定位,推论出,是gfp结合蛋白的直接结合导致gfp荧光强度增强,而排出其它增强因素;体外实验进一步证实了细胞实验结果;而且也揭示了gfp结合蛋白与gfp结合部位与gfp10-11这段结构有紧密联系。4.激光共聚焦观察,结果未发现重新组装的gfp定位到具有特征性的核膜（LNMB1）上,猜测,也许是实验细胞选取或者是融合蛋白的顺序影响了实验结果。***三分子荧光互补衍生成5个分子,无荧光,或许是蛋白较多,空间位阻效应较严重,阻碍了gfp重新结合成完整的荧光分子。结论:通过荧光对比,我们锁定了荧光强度较高的绿色荧光蛋白sf gfp,以它为基础成功的构建了三分子荧光互补技术模型,并成功筛选了3种对gfp三分子荧光互补技术具有加强效果的gfp结合蛋白,通过体外实验验证了这三个gfp结合蛋白、探索了gfp结合蛋白与gfp的结合位点,将其应用于蛋白质-蛋白质相互作用研究可能提高检测的效率和灵敏度。

关键词： super-folder gfp gfp三分子荧光互补技术 gfp结合蛋白共定位

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通过改造植物细胞自噬途径以促进蛋白质和细胞器降解的研究

通过改造植物细胞自噬途径以促进蛋白质和细胞器降解的研究

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作者：商丹丹华南农业大学

学位级别：硕士

在生长发育及应对外界胁迫的过程中,细胞内受损的蛋白和细胞器需要及时被降解,以维持细胞的稳态。为此细胞进化出了复杂而精妙的降解体系,其中两个主要的降解途径就是泛素-蛋白酶体系统和细胞自噬途径。在泛素-蛋白酶体系统中,需要降解... 详细信息

在生长发育及应对外界胁迫的过程中,细胞内受损的蛋白和细胞器需要及时被降解,以维持细胞的稳态。为此细胞进化出了复杂而精妙的降解体系,其中两个主要的降解途径就是泛素-蛋白酶体系统和细胞自噬途径。在泛素-蛋白酶体系统中,需要降解的蛋白首先被泛素分子标记,然后被蛋白酶体识别和快速降解,泛素分子被释放重新利用。作为补充机制,细胞自噬可以对胞内物质,包括蛋白聚集体、蛋白复合物和细胞器等物质进行大量降解,从而促进营养物质的循环利用。近年来,研究者们对泛素-蛋白酶体系统的利用和改造已展开广泛的研究,利用和改造细胞自噬途径的研究在动物细胞中也已展开,但植物的相关研究尚无报道。为利用和改造植物细胞自噬途径降解蛋白和细胞器,本论文人工合成了一种介导选择性自噬的衔接蛋白,通过该衔接蛋白与需降解的蛋白或细胞器及自噬囊泡的相互作用,介导了这些物质的选择性自噬降解,从而为加强营养物质循环,改善细胞稳态,为作物改良奠定理论基础。本研究得到的主要结果如下:1.从拟南芥自噬衔接蛋白编码基因At NBR1（Neighbor of BRCA1 gene 1）中克隆得到了编码AIM基序（ATG8-interacting motif）的序列,并构建了红色荧光蛋白mCherry标记的表达载体AIM-mCherry。烟草瞬时表达验证了该融合蛋白能凭借其自身的AIM基序与ATG8互作,通过自噬途径运送到液泡中降解。2.优化AIM-mCherry融合蛋白,提高与ATG8的结合能力。通过添加PB1或FYVE结构域,或将AIM基序三倍化,提高了AIM-mCherry与ATG8的结合能力。本研究发现PB1结构域的添加或AIM基序的三倍化均可以显著增强与ATG8的互作。3.添加gfp结合蛋白GBP（gfp-binding protein）,构建具有捕捉gfp融合蛋白能力的AIM-GBP-mCherry衔接蛋白。本研究发现该衔接蛋白可以通过GBP捕捉到与gfp融合表达的核定位转录因子TGA5和油菜素类固醇受体BRI1,并通过自噬途径运送到液泡中降解。4.利用衔接蛋白AIM-GBP-mCherry实现对过氧化物酶体的选择性自噬降解。本研究先通过过氧化物酶体膜蛋白PEX3的融合蛋白PEX3-YFP标记过氧化物酶体,然后借助GBP与YFP的互作捕捉过氧化物酶体,AIM基序与ATG8的互作实现对过氧化物酶体的选择性自噬降解。综上所述,本文设计了一个可以与荧光蛋白相互作用的自噬衔接蛋白,通过植物的选择性自噬途径实现了对荧光蛋白标记的蛋白和细胞器的降解,从而为利用和改造植物的细胞自噬途径提供了一条崭新的思路。

关键词：细胞自噬自噬衔接蛋白 ATG8互作基序 gfp结合蛋白

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