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食品与发酵工业 2020年第9期46卷 18-24页

作者：魏万涛李梦丽江波张涛食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

核苷酸糖鸟嘌呤5’-二磷酸-β-l-岩藻糖(5′-diphospho-β-l-fucose, gdp-l-岩藻糖)是岩藻糖基化寡糖植物和细菌生物合成途径的关键中间体。从脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的基因组DNA中克隆得到l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化... 详细信息

核苷酸糖鸟嘌呤5’-二磷酸-β-l-岩藻糖(5′-diphospho-β-l-fucose, gdp-l-岩藻糖)是岩藻糖基化寡糖植物和细菌生物合成途径的关键中间体。从脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的基因组DNA中克隆得到l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化酶(fucose pyrophosphorylase, FKP)基因,并与载体pET-22b (+)连接,在Escherichia coli Bl21(DE3)中诱导表达。利用载体上组氨酸标签对重组酶分离纯化,并进行酶学性质分析。结果表明:FKP的最适温度和最适pH分别为45℃和7.5,该酶在pH 7.5~9.5之间很稳定,在4和12℃下孵育3 h,酶的初始活性保持在90%以上。最适反应条件下,重组FKP对底物岩藻糖的Km和Kcat分别为0.44 mmol/l、(31.49±2.5) s^-1。45℃下,在底物l-岩藻糖摩尔浓度为10 mmol/l条件下反应11 h后,最终产生的gdp-l-岩藻糖为2.1 mmol/l。

关键词： l-岩藻糖激酶/gdp-l-岩藻糖焦磷酸化酶 gdp-l-岩藻糖酶学性质克隆与表达

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高山被孢霉gdp-l-岩藻糖合成途径中gdp-甘露糖-4,6-脱水酶的克隆、表达和功能鉴定

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食品与发酵工业 2016年第11期42卷 14-19页

作者：王鸿超张陈周昕陈海琴顾震南张灏陈卫陈永泉江南大学食品学院江苏无锡214122

gdp-l-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成gdp-l-岩藻糖的真菌。gdp-l-岩藻糖从头合成途径中... 详细信息

gdp-l-岩藻糖是糖复合物生物合成和糖类代谢的重要中间产物,作为岩藻糖转移酶的供体参与岩藻糖基化反应,具有重要的生理功能。高山被孢霉是重要的产油真菌,是唯一在分子水平上证明可合成gdp-l-岩藻糖的真菌。gdp-l-岩藻糖从头合成途径中的gdp-甘露糖-4,6-脱水酶(GMD)能催化gdp-D-甘露糖合成gdp-4-酮基-6-脱氧-D-甘露糖。对高山被孢霉中的GMD基因进行克隆、表达和功能鉴定,可进一步阐明gdp-l-岩藻糖体内代谢的分子生物机制。首先对GMD序列进行分析,并以p ET28a+质粒为骨架构建了GMD的表达载体,然后转化至大肠杆菌Bl21中进行诱导表达。进一步利用Ni金属螯合层析纯化目的蛋白,采用液相色谱-质谱法分析酶反应产物,表明纯化蛋白具有GMD活性。最后对高山被孢霉进行发酵培养,发现gdp-l-岩藻糖产量在氮源耗尽后较高,可达0.10 mg/g。同时GMD的转录水平在氮源耗尽后发生了明显的上调,表明GMD在氮源耗尽后对高山被孢霉体内gdp-l-岩藻糖的合成具有重要作用。这为进一步利用高山被孢霉发酵生产gdp-l-岩藻糖和酶法转化生产gdp-l-岩藻糖奠定了理论基础。

关键词：功能鉴定从头合成途径 gdp-甘露糖-4,6-脱水酶 gdp-l-岩藻糖高山被孢霉

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构建大肠杆菌细胞工厂生产gdp-l-岩藻糖

构建大肠杆菌细胞工厂生产GDP-L-岩藻糖

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作者：万李江南大学

学位级别：硕士

gdp-l-岩藻糖(guanosine 5′-diphosphate(gdp)-l-fucose)作为一种核苷酸糖,是生物体内进行岩藻糖基化修饰的重要糖基供体。此外,gdp-l-岩藻糖是合成人乳寡糖的重要中间体,在利用微生物代谢合成岩藻糖基化人乳寡糖(Human milk oligosacc... 详细信息

gdp-l-岩藻糖(guanosine 5′-diphosphate(gdp)-l-fucose)作为一种核苷酸糖,是生物体内进行岩藻糖基化修饰的重要糖基供体。此外,gdp-l-岩藻糖是合成人乳寡糖的重要中间体,在利用微生物代谢合成岩藻糖基化人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)的生物过程中发挥关键作用。因此,利用代谢工程策略构建重组菌株高效合成gdp-l-岩藻糖,对生产岩藻糖基化合物,尤其是岩藻糖基化的人乳寡糖具有重要意义。本文利用代谢工程策略改造大肠杆菌,并以葡萄糖为唯一碳源从头合成gdp-l-岩藻糖。进一步通过分批补料发酵实现了gdp-l-岩藻糖的高产量及高产率生产。主要研究结果如下:(1)将构建的重组质粒p ET-gmd-wca G和p CDF-man C-man B转入Escherichia coli Bl21(DE3)中,从而在宿主中过表达gdp-l-岩藻糖从头合成途径的四个关键酶Man B、Man C、Gmd和Wca G。重组菌株进行摇瓶发酵,在IPTG诱导培养20 h后,gdp-l-岩藻糖产量为2.0 mg/l。为平衡合成途径的代谢通量,将代谢通路的四个关键酶分为gdpD-甘露糖合成模块(上游模块,包括Man B和Man C)以及gdp-l-岩藻糖合成模块(下游模块,包括Gmd和Wca G),并分别对两个模块的表达强度进行调节。通过使用低拷贝数的质粒表达上游模块(p ACYC-man C-man B),同时使用高拷贝数的质粒表达下游模块(p ET-gmd-wca G),重组菌株的产量达到5.3 mg/l,相较于初始产量增加了1.6倍。(2)为进一步调控两个模块的表达水平,对控制蛋白翻译的元件核糖体结合位点(Ribosome binding site,RBS)的强度进行了优化。通过使用高、中、低三种不同强度的RBS组合调控目的基因的蛋白质翻译强度。结果显示,当调低上游模块的蛋白翻译强度且调高下游模块的蛋白翻译强度时,重组菌株EWl31的gdp-l-岩藻糖产量进一步提高,达到6.8 mg/l,是初始产量的3.4倍。(3)考虑到在大肠杆菌内gdp-l-岩藻糖是合成荚膜异多糖酸(Colanic acid)的前体,通过敲除大肠杆菌内源基因wca J可以阻断这一竞争代谢途径。实验结果表明,敲除wca J显著提高gdp-l-岩藻糖的胞内积累。重组菌株EWl34的gdp-l-岩藻糖产量为12.3 mg/l,是初始产量的6.1倍。(4)代谢途径中的酶Man C和Wca G分别需要辅因子鸟苷三磷酸(guanosine 5′-triphosphate,GTP)和辅酶NADPH来参与酶反应。通过过表达大肠杆菌内源表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf以及表达鸟苷-肌苷激酶的基因gsk,分别强化胞内辅酶NADPH和辅因子GTP的循环再生,从而进一步提高gdp-l-岩藻糖的产量。重组菌株EWl37的gdp-l-岩藻糖的摇瓶发酵产量进一步提升至18.3 mg/l,是初始产量的8.1倍。(5)为进一步提高gdp-l-岩藻糖的产量,对重组菌株EWl37进行了分批补料发酵。发酵结果显示,经过3 l发酵罐40 h分批补料发酵,gdp-l-岩藻糖的胞内积累量达到106 mg/l,干细胞重(Dry cell weight,DCW)达到24.8 g/l,gdp-l-岩藻糖比含量为4.3 mg/g DCW。

关键词： gdp-l-岩藻糖大肠杆菌代谢工程代谢旁路敲除辅因子再生

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