构建大肠杆菌细胞工厂生产GDP-L-岩藻糖

作     者：万李 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沐万孟

授予年度：2021年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：GDP-L-岩藻糖 大肠杆菌 代谢工程 代谢旁路敲除 辅因子再生 

摘      要：GDP-L-岩藻糖(guanosine 5′-diphosphate(GDP)-L-fucose)作为一种核苷酸糖,是生物体内进行岩藻糖基化修饰的重要糖基供体。此外,GDP-L-岩藻糖是合成人乳寡糖的重要中间体,在利用微生物代谢合成岩藻糖基化人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)的生物过程中发挥关键作用。因此,利用代谢工程策略构建重组菌株高效合成GDP-L-岩藻糖,对生产岩藻糖基化合物,尤其是岩藻糖基化的人乳寡糖具有重要意义。本文利用代谢工程策略改造大肠杆菌,并以葡萄糖为唯一碳源从头合成GDP-L-岩藻糖。进一步通过分批补料发酵实现了GDP-L-岩藻糖的高产量及高产率生产。主要研究结果如下:(1)将构建的重组质粒p ET-gmd-wca G和p CDF-man C-man B转入Escherichia coli BL21(DE3)中,从而在宿主中过表达GDP-L-岩藻糖从头合成途径的四个关键酶Man B、Man C、Gmd和Wca G。重组菌株进行摇瓶发酵,在IPTG诱导培养20 h后,GDP-L-岩藻糖产量为2.0 mg/L。为平衡合成途径的代谢通量,将代谢通路的四个关键酶分为GDPD-甘露糖合成模块(上游模块,包括Man B和Man C)以及GDP-L-岩藻糖合成模块(下游模块,包括Gmd和Wca G),并分别对两个模块的表达强度进行调节。通过使用低拷贝数的质粒表达上游模块(p ACYC-man C-man B),同时使用高拷贝数的质粒表达下游模块(p ET-gmd-wca G),重组菌株的产量达到5.3 mg/L,相较于初始产量增加了1.6倍。(2)为进一步调控两个模块的表达水平,对控制蛋白翻译的元件核糖体结合位点(Ribosome binding site,RBS)的强度进行了优化。通过使用高、中、低三种不同强度的RBS组合调控目的基因的蛋白质翻译强度。结果显示,当调低上游模块的蛋白翻译强度且调高下游模块的蛋白翻译强度时,重组菌株EWL31的GDP-L-岩藻糖产量进一步提高,达到6.8 mg/L,是初始产量的3.4倍。(3)考虑到在大肠杆菌内GDP-L-岩藻糖是合成荚膜异多糖酸(Colanic acid)的前体,通过敲除大肠杆菌内源基因wca J可以阻断这一竞争代谢途径。实验结果表明,敲除wca J显著提高GDP-L-岩藻糖的胞内积累。重组菌株EWL34的GDP-L-岩藻糖产量为12.3 mg/L,是初始产量的6.1倍。(4)代谢途径中的酶Man C和Wca G分别需要辅因子鸟苷三磷酸(guanosine 5′-triphosphate,GTP)和辅酶NADPH来参与酶反应。通过过表达大肠杆菌内源表达葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因zwf以及表达鸟苷-肌苷激酶的基因gsk,分别强化胞内辅酶NADPH和辅因子GTP的循环再生,从而进一步提高GDP-L-岩藻糖的产量。重组菌株EWL37的GDP-L-岩藻糖的摇瓶发酵产量进一步提升至18.3 mg/L,是初始产量的8.1倍。(5)为进一步提高GDP-L-岩藻糖的产量,对重组菌株EWL37进行了分批补料发酵。发酵结果显示,经过3 L发酵罐40 h分批补料发酵,GDP-L-岩藻糖的胞内积累量达到106 mg/L,干细胞重(Dry cell weight,DCW)达到24.8 g/L,GDP-L-岩藻糖比含量为4.3 mg/g DCW。