检索结果-南通市图书馆

微生物学通报 2024年第3期51卷 970-984页

作者：林馨倩郭紫晶张瑞向晗一林含睿黄雄挺陈劲松张志东李彦敏西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室四川成都610041

【背景】Ras-gTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-gTPase-activating protein SH3 domain binding protein 1,g3bp1)是应激颗粒(stress granule,Sg)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建g3bp1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、塞内卡病毒(seneca virus,SVV)和痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、抗黏病毒蛋白1(myxovirus resistance protein 1,Mx1)、干扰素刺激基因54(IFN-stimulated gene 54,ISg54)和干扰素β(interferonβ,IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISg54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Western blotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低g3bp1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISg54和IFN-β的mRNA表达水平(PG3BP1基因可极显著抑制上述细胞因子的mRNA表达(PG3BP1基因对VACV抑制的细胞因子mRNA表达无显著影响(P>0.05);理化性质预测结果显示,猪源g3bp1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测显示,该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(52.47%)组成,主要定位于细胞质和细胞核中,分别占34.38%和31.25%。【结论】本研究获得了猪源G3BP1基因稳定敲低的PK-15细胞系,敲低该基因可极显著促进VSV和SVV的复制,但对VACV的复制无显著影响;敲低该基因可显著或极显著抑制TNF-α、IL-6、Mx1、ISg54和IFN-β的产生;预测该蛋白存在30个磷酸化位点,为非跨膜和非分泌蛋白,具有不稳定性和亲水性。这些结果可为进一步研究g3bp1在病毒感染过程中的作用机制提供工具和参考依据。

关键词： PK-15细胞 G3BP1基因细胞因子生物信息学

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g3bp1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究

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中国兽医科学 2023年第8期53卷 977-982页

作者：高雁怩郭承意姜晓琳赵栩白娟南京农业大学动物医学院、农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定g3bp1敲... 详细信息

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定g3bp1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(g3bp1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明g3bp1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株g3bp1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究g3bp1对SVA复制的影响奠定了基础。

关键词： G3BP1基因基因敲除 293T细胞塞内卡病毒A 复制

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