猪源G3BP1基因的稳定敲低PK-15细胞系构建及生物信息学分析

作     者：林馨倩 郭紫晶 张瑞 向晗一 林含睿 黄雄挺 陈劲松 张志东 李彦敏 LIN Xinqian;GUO Zijing;ZHANG Rui;XIANG Hanyi;LIN Hanrui;HUANG Xiongting;CHEN Jingsong;ZHANG Zhidong;LI Yanmin

作者机构：西南民族大学动物医学四川省高校重点实验室四川成都610041 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2024年第51卷第3期

页      面：970-984页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 090602[农学-预防兽医学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：西南民族大学引进高层次人才科研资助金项目(RQD202100) 四川省自然科学基金(2022NSFSC0073) 中央高校基本科研业务费专项基金(ZYN2023042) 

主　　题：PK-15细胞 G3BP1基因 细胞因子 生物信息学 

摘      要：【背景】Ras-GTP酶活化蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras-GTPase-activating protein SH3 domain binding protein 1,G3BP1)是应激颗粒(stress granule,SG)的重要组成部分和标志性蛋白,在宿主抵抗病原体入侵过程中发挥重要作用。【目的】构建G3BP1稳定敲低的PK-15细胞系,探究敲低G3BP1基因对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)、塞内卡病毒(seneca virus,SVV)和痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)复制的影响和对肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、抗黏病毒蛋白1(myxovirus resistance protein 1,Mx1)、干扰素刺激基因54(IFN-stimulated gene 54,ISG54)和干扰素β(interferonβ,IFN-β)表达的影响,并对该基因进行生物信息学分析。【方法】利用慢病毒载体构建稳定敲低G3BP1基因的PK-15细胞系,利用逆转录实时定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR,RT-qPCR)和实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)分析敲低G3BP1基因对VSV、SVV和VACV复制的影响,利用RT-qPCR分析感染VSV、SVV和VACV后敲低G3BP1基因对TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的影响,通过在线工具对G3BP1基因进行生物信息学分析。【结果】RT-qPCR和免疫印迹(Western blotting,WB)结果显示成功构建稳定敲低G3BP1的PK-15细胞系;RT-qPCR和qPCR结果显示敲低G3BP1基因可极显著促进VSV和SVV的复制(P0.05);RT-qPCR结果显示VSV和SVV感染可显著或极显著促进TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的mRNA表达水平(P0.05);理化性质预测结果显示,猪源G3BP1蛋白存在30个磷酸化位点,具有不稳定性和亲水性,属于非跨膜和非分泌蛋白;蛋白质高级结构预测显示,该蛋白的二级结构主要由无规则卷曲(52.47%)组成,主要定位于细胞质和细胞核中,分别占34.38%和31.25%。【结论】本研究获得了猪源G3BP1基因稳定敲低的PK-15细胞系,敲低该基因可极显著促进VSV和SVV的复制,但对VACV的复制无显著影响;敲低该基因可显著或极显著抑制TNF-α、IL-6、Mx1、ISG54和IFN-β的产生;预测该蛋白存在30个磷酸化位点,为非跨膜和非分泌蛋白,具有不稳定性和亲水性。这些结果可为进一步研究G3BP1在病毒感染过程中的作用机制提供工具和参考依据。