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g250异种化复合抗原抗肾癌基因疫苗的构建和表达

G250异种化复合抗原抗肾癌基因疫苗的构建和表达

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作者：田仁礼中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

g250(mn/caix)是肾癌特异性的肿瘤相关抗原,因其在肾细胞癌中的特异性表达而广泛应用于肾细胞癌的免疫治疗。本研究的目的是构建含有人肾细胞癌特异性抗原g250(caix)主要T细胞表位区域、猴和鼠caix部分片段区域融合基因异种化融合抗原t... 详细信息

g250(mn/caix)是肾癌特异性的肿瘤相关抗原,因其在肾细胞癌中的特异性表达而广泛应用于肾细胞癌的免疫治疗。本研究的目的是构建含有人肾细胞癌特异性抗原g250(caix)主要T细胞表位区域、猴和鼠caix部分片段区域融合基因异种化融合抗原tg250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中鉴定其表达情况。首先通过文献调研,确定人g250(caix)的主要抗原表位集中区域,并在genebank中查找其相应的基因序列;在genbank中查找猴和鼠的caix基因序列;通过DNAMAN软件对人、猴和鼠caix的基因序列进行对比,保留人g250抗原表位集中区域,其余部分以猴和鼠的caix基因序列替代;使设计的异种化序列与除去信号肽的人g250胞外段序列同源性达到89%。然后通过基因合成和PCR拼接技术构建人、猴和鼠g250区域融合的异种化抗原基因tg250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽(sig)、人Igg-Fc和糖基磷脂酰肌醇(gPI)锚定信号肽的真核表达载体pCI-Fc-gPI中,继而又将酶切后的sig-tg250-Fc-gPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点(IRES)基因且可以共表达人gM-CSF和B7.1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-gM/B7中,获得g250异种化复合抗原抗肾癌DNA疫苗pVAX1-sig-tg250-Fc-gPI-gM/B7(简称pVAX1-tg250FcgB)。最后,将构建的DNA疫苗质粒转染COS7细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果:异种化复合抗原tg250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX1-IRES-gM/B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组DNA疫苗质粒pVAX1-tg250FcgB在COS7细胞中得到很好的表达。本研究的实验结果证明:成功构建了异种化复合抗原tg250,经测序与预期一致。构建的重组DNA疫苗质粒pVAX1-tg250FcgB可以在COS7细胞中有效表达,为进一步进行功能研究奠定了基础。本研究构建的免疫增效异种化复合g250抗原DNA疫苗,为肾癌的免疫基因治疗提供了新的技术策略。

关键词：肾肿瘤基因疫苗免疫治疗 g250-mn/caix

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