G250异种化复合抗原抗肾癌基因疫苗的构建和表达

作     者：田仁礼 

作者单位：中国人民解放军军医进修学院 

学位级别：硕士

导师姓名：高江平;于继云

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肾肿瘤 基因疫苗 免疫治疗 G250-MN/CAIX 

摘      要：G250(MN/CAIX)是肾癌特异性的肿瘤相关抗原,因其在肾细胞癌中的特异性表达而广泛应用于肾细胞癌的免疫治疗。 本研究的目的是构建含有人肾细胞癌特异性抗原G250(CAIX)主要T细胞表位区域、猴和鼠CAIX部分片段区域融合基因异种化融合抗原tG250的真核表达质粒,并在猴肾COS7细胞中鉴定其表达情况。首先通过文献调研,确定人G250(CAIX)的主要抗原表位集中区域,并在Genebank中查找其相应的基因序列;在Genbank中查找猴和鼠的CAIX基因序列;通过DNAMAN软件对人、猴和鼠CAIX的基因序列进行对比,保留人G250抗原表位集中区域,其余部分以猴和鼠的CAIX基因序列替代;使设计的异种化序列与除去信号肽的人G250胞外段序列同源性达到89%。然后通过基因合成和PCR拼接技术构建人、猴和鼠G250区域融合的异种化抗原基因tG250,将其插入含有人Igκ链前导信号肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的真核表达载体pCI-Fc-GPI中,继而又将酶切后的sig-tG250-Fc-GPI融合基因导入含有细小病毒内部核糖体结合位点(IRES)基因且可以共表达人GM-CSF和B7.1融合基因的真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中,获得G250异种化复合抗原抗肾癌DNA疫苗pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-GM/B7(简称pVAX1-tG250FcGB)。最后,将构建的DNA疫苗质粒转染COS7细胞,利用流式细胞仪和免疫荧光检测其表达情况。结果:异种化复合抗原tG250融合基因经测序正确,PCR和酶切鉴定证明已成功连入真核表达载体pVAX1-IRES-GM/B7中;流式细胞仪和免疫荧光的检测结果显示,重组DNA疫苗质粒pVAX1-tG250FcGB在COS7细胞中得到很好的表达。 本研究的实验结果证明:成功构建了异种化复合抗原tG250,经测序与预期一致。构建的重组DNA疫苗质粒pVAX1-tG250FcGB可以在COS7细胞中有效表达,为进一步进行功能研究奠定了基础。本研究构建的免疫增效异种化复合G250抗原DNA疫苗,为肾癌的免疫基因治疗提供了新的技术策略。