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基于链置换触发g四联体/RCA的外泌体源性microRNAs电化学传感技术的构建

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基于链置换触发G四联体/RCA的外泌体源性microRNAs电化学传感技术...

作者：汤晓琦中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

液体活检是以患者的体液作为肿瘤活检样本的一类非侵入性诊断方式。外泌体源性microRNAs作为液体活检中的重要组成部分,在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药中发挥着重要作用。相对于体液中游离的microRNAs,外泌体源性microRNAs在血清中的... 详细信息

液体活检是以患者的体液作为肿瘤活检样本的一类非侵入性诊断方式。外泌体源性microRNAs作为液体活检中的重要组成部分,在肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药中发挥着重要作用。相对于体液中游离的microRNAs,外泌体源性microRNAs在血清中的数量与稳定性方面具有独特的优势,且外泌体源性microRNAs是通过特定分拣机制整合入外泌体中的,这种机制的存在使得外泌体中的microRNAs能够更特异地反映肿瘤细胞的基因特性。大量证据表明,外泌体源性的microRNAs与乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌等多种癌症的发生发展有关,癌组织中外泌体衍生的microRNAs水平异常升高,因此外泌体源性的microRNAs是肿瘤早期诊断、疗效监测和预后评估的潜在生物标记物。然而,仍有一些技术和生物学上的局限性阻碍了外泌体源性microRNAs的临床检测。逆转录PCR（RT-PCR）是临床应用最广泛的方法,但是该方法对加样环境和人员要求较高,容易造成孔间交叉污染,且若样品中microRNAs逆转录水平低或含有抑制性物质,也会导致假阴性结果产生。生物传感器是一类多种学科交叉的高新技术,它集高效与小巧于一身,操作简便,成本低廉,对实验设备与操作人员无特殊要求,近年来已被广泛运用于临床核酸和蛋白检测,甚至用于研发军事战地诊断装备。其中电化学生物传感器是一类通过固定在电极表面的生物分子识别元件将待测靶标的浓度转化为可测电信号的具有经济、快速、简便等特点的新型传感技术,近年来已经成为了研究者们探究的热点。由于电化学生物传感器更适用于低浓度、复杂生物体系的分子检测,因此目前已被广泛应用于临床核酸及蛋白检验、食品安全检测和环境监测等领域。本研究的目的是构建一个用于外泌体源性microRNAs检测的高特异性、高灵敏度、操作简便的电化学生物传感器。方法是利用锁核酸修饰的链置换反应捕获目标序列microRNA-21,再通过g四联体/滚环扩增（RCA）信号放大策略,我们实现了外泌体源性microRNAs的高特异性、高灵敏度的电化学生物传感,并初步探索该传感器应用于临床的准确性。论文内容主要包括一下几个部分:第一章前言简要介绍了外泌体源性microRNAs检测的重要临床意义以及方法学现状;并介绍了生物传感器的优点和应用进展,着重论述了电化学生物传感器的优点以及应用;阐述了本论文的研究目标。第二章基于链置换触发g四联体/RCA信号放大策略的电化学生物传感器的构建极其在外泌体源性microRNAs检测中的初步应用近年来,为了实现痕量microRNAs的检测,研究者们构建了基于各种信号放大策略的生物传感器。其中,RCA是一种新型的恒温线性核酸扩增技术,该技术由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点,近年来得到了不断的发展。另外,g四联体作为应用最广泛的DNA酶,它能够与亚甲蓝通过π-π末端堆积更加高效的结合,从而达到更理想的信号放大效果以及更灵敏的检测目的,常被用于构建电化学生物传感器。此外,位点介导的链置换反应（TMSDR）是一种由较短的悬垂单链区域启动的,能够在恒定的温度和位移条件下高效地完成对目标序列特异性识别的反应,其作为一种特异的识别策略已被广泛应用于各种生物传感器的构建中。同时,锁核酸（LNA）能显著提高碱基错配序列与互补双链之间的解链温度（Tm）差异,进一步提高识别系统的特异性和准确性。锁核酸协同TMSDR辅助的磁珠分离技术将有助于外泌体源性microRNAs的特异性检测。基于此,我们构建了基于链置换触发的g四联体/RCA信号放大策略的电化学生物传感器用于外泌体源性microRNAs的检测。在目标序列外泌体源性microRNA-21存在下,锁核酸修饰的TMSDR将会被启动,目标序列将功能探针P2替换下来,P2通过其一端与富含C碱基的RCA模板结合,触发RCA反应。富含g碱基的RCA产物可以与金电极上的ssDNA探针结合,在K+的参与下进一步折叠成g四联体。最后将电化学信号指示剂亚甲基蓝高效地嵌入g四联体结构中获得电化学信号,成功地实现外泌体源性microRNAs的超灵敏生物传感。基于该信号放大策略,此电化学生物传感器峰电流强度增加值与microRNA-21浓度的增加值在10 fM～10 nM的范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.9972,且其检测限低至2.75 fM。此外,与RT-PCR相比,我们所构建的生物传感器具有良好的重复性、稳定性和高一致性。因此,本研究有望为癌症的早期无创诊断和预后评估提供一种简便有效的策略。

关键词：外泌体源性microRNAs 锁核酸链置换滚环扩增 g四联体生物传感器

基于g四联体信号循环放大策略的适配子传感器用于腺苷的比色检测

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基于G四联体信号循环放大策略的适配子传感器用于腺苷的比色检测

作者：徐磊南京医科大学

学位级别：硕士

腺苷是一种重要的内源性核苷,是影响机体核酸及能量代谢的关键物质。研究表明,腺苷可作为多种肿瘤的生物标志物,其浓度水平与肿瘤的发生与转归过程存在紧密联系,尤其在肺癌患者的血浆中往往能检测到高浓度的腺苷。因此,腺苷的高灵敏度... 详细信息

腺苷是一种重要的内源性核苷,是影响机体核酸及能量代谢的关键物质。研究表明,腺苷可作为多种肿瘤的生物标志物,其浓度水平与肿瘤的发生与转归过程存在紧密联系,尤其在肺癌患者的血浆中往往能检测到高浓度的腺苷。因此,腺苷的高灵敏度检测对于肿瘤的早期筛查与诊断具有重要意义。本研究结合了腺苷特异性的核酸适配体以及基于核酸外切酶III的循环信号扩增技术,提出了一种低成本、高灵敏度的免标记比色传感策略用于腺苷的检测。本方案使用了两个无标记的发卡状核酸探针HP1及HP2,其中HP1包含了腺苷适配体,而HP2则包含富鸟苷酸序列用于形成g四联体结构。当腺苷存在时,腺苷能与HP1的适配体部分特异性结合,形成腺苷-HP1复合物,改变HP1构象,暴露出HP1的3’末端单链。这段单链进而与发卡状HP2杂交,形成腺苷-HP1-HP2三元复合物。此复合物被核酸外切酶III降解后,一方面,腺苷-HP1复合物被释放,重新结合剩余的HP2,实现循环信号放大过程;另一方面,降解后残留的HP2片段暴露出的富鸟苷酸序列形成g四联体,并催化四甲基联苯胺显色,可通过肉眼观察颜色变化或测定溶液吸光度实现定量。若腺苷不存在,则发卡结构的HP1无法自行打开,从而无法引发下游反应,最终导致较低的吸光度。本方案中,腺苷与适配体的特异性结合保证了方法专属性,而基于核酸外切酶III的循环信号放大反应则提高了灵敏度。本方案的检测限为17 nmol L,线性范围为50 nmol L-6μmol L,且能应用于血浆样品中腺苷的定量检测。

关键词： g四联体腺苷比色传感信号放大适配体传感

基于g四联体DNA模拟酶和接合探针的核酸检测新方法研究

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基于G四联体DNA模拟酶和接合探针的核酸检测新方法研究

作者：王旭楚浙江大学

学位级别：硕士

g四联体(g4)是一种特殊的核酸二级结构,其由富含鸟嘌呤碱基(g)的寡核苷酸序列通过Hoogsteen键连接而成。在含有一些单价金属离子的溶液中,g4可与氯化血红素单体(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的功能性寡核苷酸结构,又被称为 DNA 模... 详细信息

g四联体(g4)是一种特殊的核酸二级结构,其由富含鸟嘌呤碱基(g)的寡核苷酸序列通过Hoogsteen键连接而成。在含有一些单价金属离子的溶液中,g4可与氯化血红素单体(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的功能性寡核苷酸结构,又被称为 DNA 模拟酶(peroxidase-mimicking DNAzyme)。利用 DNA 模拟酶作为信号检测元件对于核酸检测具有极强的便携性,然而现今基于DNA模拟酶的核酸均相检测方式具有较大的检测背景,从而阻碍了 DNA模拟酶在核酸均相检测中的广泛应用。接合探针(junction probe,JP)源于双探针概念(binary probe,BP),在一个系统中,当且仅当两条探针同时与靶核酸序列杂交时可产生杂交信号,使其具有极强的杂交特异性,并且有潜力被运用于核酸的均相检测。传统的接合探针由于有较大的非特异性杂交概率,而使其需要经过复杂的序列设计及优化,这增加了检测的成本。本研究在前人研究的基础上,通过构建基于链置换技术(strand displacement)的接合探针,并整合g四联体用于核酸的便携检测,并初步评价其检测效能。论文主要分为以下两个章节:在第一章的研究中,我们将分裂的g-四联体形成序列整合于两个探针中。只有在含有特异性可识别剪接位点的靶基因转录本存在时,探针可相互组装形成三向接合构象,从而提供功能性的g-四联体构象,其与氯化血红素单体结合后可大大增强氯化血红素的过氧化酶活性。该系统对通过比色测定对靶基因转录本的检测限为0.063 μM,并且可特异地识别靶序列中的单碱基突变(约需3倍量的突变序列才能使检测体系获得与靶序列等同的信号)。该接合探针识别的靶序列可长达46 bp,并且无需复杂的序列设计步骤,显示出其用于进一步构建简便、高效的核酸检测系统的潜力。第二章中,我们构建了一种用于核酸靶序列识别和信号放大的方法。核酸扩增基于链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA),其中两条 DNA 探针在抑制链(inhibitor)作用下不相互组装触发下游链置换扩增。但在靶序列存在时,探针可通过靶序列诱导的三向接合结构形成(核心原理见第一章节)释放抑制链,随后触发SDA反应扩增富C(胞嘧啶)序列模板,这导致一系列富g(鸟嘌呤)序列生成,其与氯化血红素单体结合表现出强大的过氧化物酶活性。用TMB作为底物并将产物在450nm的波长下测定时时,其具有0.8 pM的检测限。该检测系统具有极低的检测背景以及核酸检测的高选择性。

关键词： g四联体接合探针链置换反应链置换扩增

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基于数据质控的全基因组g四联体结构分析

基于数据质控的全基因组G四联体结构分析

作者：段梦沁东南大学

学位级别：硕士

g四联体是一种由富含鸟嘌呤的核酸序列通过Hoogensten氢键折叠形成的二级结构。作为一种重要的基因表达调控元件,g四联体在人基因组大量分布。目前对于g四联体在体外的物化性质、空间结构等性质都有了较详细的研究。但对于全基因组范围... 详细信息

g四联体是一种由富含鸟嘌呤的核酸序列通过Hoogensten氢键折叠形成的二级结构。作为一种重要的基因表达调控元件,g四联体在人基因组大量分布。目前对于g四联体在体外的物化性质、空间结构等性质都有了较详细的研究。但对于全基因组范围内实际可形成的g四联体的分布和功能的研究仍存在一定困难。本课题针对gM12878细胞系全基因组中g四联体结构进行了研究,基于Perl程序语言撰写脚本,建立了一套生物信息学的分析流程,从常规二代测序数据中挖掘出具有形成g四联体潜力的序列(QgRS),并对其检出g四联体的性能进行了评估,最后对单碱基突变造成的g四联体形成影响进行了简单研究。我们利用了测序过程中模板链上g四联体的形成将对合成链序列质量造成影响的性质,对每个位点的序列质量值计算了中位数,并以此作为该位点质量值的分数。在流程的核心部分,即OQ(Observed QgRS)的检测中,我们设计了一种比较两位点质量值的逐点扫描筛选法,这是一种在小范围区域内基于当前质量值情况的比较法,可避免单一阈值不能应对大范围的无质量值起伏导致漏选或多选的问题。我们还建立了一套算法参数调整的方案,使其适用于各种样本的筛选。对于PQ的预测,我们使用了一种基于机器学习算法的QgRS预测软件g4predict对参考序列(hg19)进行了全基因组范围内的预测。共得到了356,298个PQ(Predicted QgRS),其中正义链为178,606个,反义链有177,692个。在全基因组范围内,我们利用序列的质量值变化筛选出低质量区域最终从两批gM12878测序数据中分别检测出1,054,941个和936,545个OQ,约为PQ数量的2.7倍,总长度为基因组非N区序列长度的3%左右。对OQ中包含的QgRS结构按照QgRS的种类分类的结果显示,我们共成功检测出经典型、长环型、突起型和2g型四种,并从没有QgRS的序列中检测出了其他二级结构(i-motif、发卡结构、三螺旋结构)的存在。总体而言,仍有约6.3%的OQ无法被分类。我们评估了OQ与PQ序列重合的比例,统计出可被OQ检测出的PQ的数量(PQinOQ),两批数据分别检测出了185,822个和172,946个PQ,占总PQ的52.2%和48.5%。较低的OQ长度和较高的PQ检出率显示了本流程筛选的OQ的高准确性。对PQ和PQinOQ的结构做分类统计证实了环长度较短的g四联体在Na环境下显示出了更强的稳定性。本课题得到的QgRS富集结果与2015年一项在添加了K和PDS的促g四联体形成的条件下完成的全基因组QgRS筛选阳性结果进行了比较,其中超过80%的PQinOQ在两种实验中是一致的。在基因组的不同功能区域中对OQ和PQinOQ的密度进行统计结果中,PQinOQ的分布与g四联体承担的一般功能相符合,在转录起始位点和启动子区域呈现出最大密度。OQ序列,尤其是包含了经典型g四联体的OQ,除了基因调控区域外,在编码区也有较多分布。对于部分基因,我们使用了IgV Tools对这些位点的中位质量值和OQ及PQ的分布进行了可视化分析。针对单碱基突变(SNP)我们研究了gM12878基因组的1号染色体数据。按照纯合和部分杂合SNP位点信息修正PQ预测信息,修正后的PQinOQ的结果较未修正增加了126个,体现出修正后的参考序列预测得到的结果更接近实际序列情况。我们对几处杂合SNP位点相关序列进行了抓取和观测,直观证实了不同基因型带来的质量值的变化则可验证单个碱基的突变确实可以影响g四联体的形成。

关键词： g四联体二代测序 DNA二级结构单碱基突变

g四联体稳定的脂质体DNA胶束用于细胞多色成像

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G四联体稳定的脂质体DNA胶束用于细胞多色成像

以端粒DNA的g四联体为作用靶点的端粒酶抑制剂

中国化学会第30届学术年会

作者：金程张晓兵谭蔚泓湖南大学分子科学与分子医学实验室

脂质体键连的DNA链在水溶液中通过亲疏水作用自组装形成DNA胶束,DNA分子的可编程性及胶束的自组装特性使得DNA胶束在疾病诊断治疗中具有极大的潜力。然而,脂质体DNA胶束易于与血浆蛋白作用而裂解,易铆钉在细胞膜上而难于进入细胞,使得... 详细信息

脂质体键连的DNA链在水溶液中通过亲疏水作用自组装形成DNA胶束,DNA分子的可编程性及胶束的自组装特性使得DNA胶束在疾病诊断治疗中具有极大的潜力。然而,脂质体DNA胶束易于与血浆蛋白作用而裂解,易铆钉在细胞膜上而难于进入细胞,使得脂质体DNA胶束更广泛的应用受到限制。本文在脂质体与DNA链之间合成g碱基,胶束形成后,脂质体DNA链之间生成g四联体,g四联体的形成大大地提高了该胶束在血浆白蛋白溶液中的稳定性及跨膜穿透细胞的能力。通过混合组装带有可荧光共振能量转移染料的脂质体DNA分子,实现了细胞内的多色成像。

关键词：脂质体DNA胶束 g四联体多色成像

来源： cnki会议评论

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医学信息（中旬刊） 2011年第5期24卷 1994-1995页

作者：张波潘庆东攀成钢青白江医院药剂科四川成都610300

端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，端粒酶的活化是细胞永生化和肿瘤发生所必需的，因此抑制端粒酶活性可能抑制肿瘤的生长和转移。端粒是端粒酶作用的靶位，端粒酶要结合到端粒上才能起作用。端粒部位富含g，g四联体在体外能抑... 详细信息

端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，端粒酶的活化是细胞永生化和肿瘤发生所必需的，因此抑制端粒酶活性可能抑制肿瘤的生长和转移。端粒是端粒酶作用的靶位，端粒酶要结合到端粒上才能起作用。端粒部位富含g，g四联体在体外能抑制端粒酶的活性，g四联体就成了新的抗肿瘤药物靶位。几种基于g四联体的端粒酶抑制剂。

关键词：端粒端粒酶 g四联体肿瘤

金属阳离子对膝沟藻毒素适配体(gO18-T-d)g四联体结构的影响

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生物化工 2020年第5期6卷 116-117,120页

作者：章琪刘建平复旦大学生命科学学院上海200438

利用圆二色谱技术解析g四联体拓扑结构类型,构建适配体的三维全原子模型,并对适配体gO18-T-d的恒温与升温分子进行动力学模拟,对g四联体在模拟过程中的RMSD波动以及形成g四联体结构的Hoosgteen氢键数目变化进行分析。结果显示,3种离子... 详细信息

利用圆二色谱技术解析g四联体拓扑结构类型,构建适配体的三维全原子模型,并对适配体gO18-T-d的恒温与升温分子进行动力学模拟,对g四联体在模拟过程中的RMSD波动以及形成g四联体结构的Hoosgteen氢键数目变化进行分析。结果显示,3种离子对适配体gO18-T-d的g四联体结构稳定性贡献度为K+>Na+>Mg2+,与圆二色色谱实验结果一致,这一发现对于稳定g四联体结构提供了一定的理论指导。

关键词： g四联体金属离子圆二色谱分子动力学模拟

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基于g四联体荧光复合物的生物成像研究

基于G四联体荧光复合物的生物成像研究

ULK1启动子区含有抑制ULK1转录的g4结构

中国化学会第三届菁青论坛

作者：聂舟湖南大学化学化工学院化学生物传感与计量学国家重点实验室

在生物体内,一些富g序列通过Hoogsteen氢键和π-π堆积作用折叠形成g四联体的四链结构。g四联体在端粒保持、转录和翻译调控中起着重要作用。近年来,相关研究发现丙肝病毒等病毒基因组中也存在g四联体结构,并在病毒的生命周期中扮演着... 详细信息

在生物体内,一些富g序列通过Hoogsteen氢键和π-π堆积作用折叠形成g四联体的四链结构。g四联体在端粒保持、转录和翻译调控中起着重要作用。近年来,相关研究发现丙肝病毒等病毒基因组中也存在g四联体结构,并在病毒的生命周期中扮演着重要角色。我们发展了一系列的g四联体探针,开展了其在生物成像领域的研究,具体研究工作如下:（1）发展了末端转移酶（TdT酶）介导g四联体合成的信号放大方法,基于此开发了一种快速灵敏、免标记和免洗的监测细胞凋亡的新方法（TAgS法）,实现了细胞和组织中凋亡细胞的原位荧光成像;（2）模拟荧光蛋白的发光机制,开发出了基于g四联体的具高量子产率、优异的抗光漂白性和双光子荧光等独特的性质人工红色荧光蛋白模拟物,成功地将人工模拟红色荧光蛋白用于细胞膜靶蛋白的成像以及双光子组织成像;（3）改造硫黄素T分子获得的新型的g四联体荧光探针能够高特异性、快速地结合丙肝病毒（HCV）基因组中的g四联体,而实现对活细胞中的HCV成像及监控;（4）我们将反应型小分子与g四联体自组装构建了一种新型的核酸传感器,对细胞膜微环境中的信号分子（例如SO2衍生物和NO）进行比例型监测。（5）以功能性核酸作为工具包,我们构建了一种DNA介导的化学诱导二聚（D-CID）纳米装置,实现了非遗传受体改造的细胞行为调控,并进一步发展了近红外光激活的DNA纳米激动剂,实现了远程调控活体动物细胞信号传导和行为。

关键词： g四联体生物成像 DNA模拟物

来源： cnki会议评论

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中国病理生理杂志 2021年第7期37卷 1270-1276页

作者：刘雪萍黄伟伟李晓梅西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

目的:研究g四联体(g-quadruplex,g4)结构对UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)基因的转录调控作用。方法:分析ULK1转录起始点上游1000 bp启动子序列的g/C含量;预测ULK1启动子区g4形成序列,利用圆二色谱、非变性聚丙烯酰胺凝胶电... 详细信息

目的:研究g四联体(g-quadruplex,g4)结构对UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)基因的转录调控作用。方法:分析ULK1转录起始点上游1000 bp启动子序列的g/C含量;预测ULK1启动子区g4形成序列,利用圆二色谱、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA银染鉴定g4;通过构建ULK1启动子报告基因质粒和用g4配体处理人前列腺癌DU-145细胞,结合报告基因检测、RT-qPCR和Western blot实验检测g4对ULK1转录的调控作用。结果:ULK1启动子区g/C含量丰富;预测发现10条g4形成序列;体外实验表明g4形成序列可以形成g4结构;细胞实验表明ULK1启动子区的g4结构负调控ULK1的转录。结论:ULK1启动子区可形成抑制ULK1转录的g4结构。这为揭示ULK1的转录调控机制提供了新的线索。

关键词： UNC-51样激酶1 g四联体圆二色谱转录调控