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微生物学通报 2015年第10期42卷 1952-1961页

作者：张俊玲章炉军刘建辉李亮尚晓冬谭琦南京农业大学生命科学学院江苏南京210095 上海市农业科学院食用菌研究所国家食用菌工程技术研究中心上海201403

【目的】评价5种不同脱毒方法对金针菇(Flammulina velutipes)菌株的脱毒效果,筛选出脱毒率高和脱毒后金针菇菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等性状改善明显的脱毒方法。【方法】以栽培金针菇菌株F-4889为研究材料,从菌丝体中提取... 详细信息

【目的】评价5种不同脱毒方法对金针菇(Flammulina velutipes)菌株的脱毒效果,筛选出脱毒率高和脱毒后金针菇菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等性状改善明显的脱毒方法。【方法】以栽培金针菇菌株F-4889为研究材料,从菌丝体中提取大小约2.0 kb的病毒dsRNA,经RT-PCR鉴定该病毒为金针菇褐化病毒(fvbv)。采用菌丝尖端分离、原基组织分离、原生质体单核化、有性生殖和核迁移5种脱毒方法对金针菇菌株进行脱毒处理,利用dsRNA技术和RT-PCR检测脱毒效果。【结果】菌丝尖端分离脱毒后得到1株脱毒菌株;原基组织分离法未能脱毒;原生质体单核化脱毒法得到3株脱毒单核菌株和2株原单杂交脱毒菌株;有性生殖脱毒法获得脱毒孢子单核菌株23株和单孢杂交脱毒菌株8株;核迁移脱毒后得到5株核迁移脱毒菌株。脱毒率依次为25.0%、0、7.5%、57.5%和100%。脱毒菌株的菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等均优于出发菌株、菌丝尖端和原基组织分离菌株。【结论】这5种方法中原生质体单核化、有性生殖和核迁移脱毒法脱毒效果较佳,均能有效脱除Fv BV,脱毒率高,脱毒后菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等均明显提高。

关键词： dsRNA技术反转录PCR fvbv 脱毒原生质体单核化有性生殖核迁移

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金针菇病毒dsRNA快速检测和脱毒方法的研究

金针菇病毒dsRNA快速检测和脱毒方法的研究

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作者：张俊玲南京农业大学

学位级别：硕士

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病... 详细信息

金针菇(Flammunlinavelutipes)是一种栽培范围广、栽培量大的食用菌。病害防控是金针菇栽培生产过程中重要的技术难点,病毒病是众多病害的一种,具有潜伏期长、病症不稳定和不明显等特点,一旦发生将造成巨大的经济损失。因此,对金针菇病毒快速检测,对带病毒菌株进行脱毒处理,为研究和生产提供无病毒优质菌种,对优化市场种质资源、育种选材、栽培生产等具有重要意义。本研究以39个金针菇品种为研究对象,其中21个国内市场上主栽品种,利用dsRNA技术、透射电镜、反转录PCR(RT-PCR)等分子生物学和病毒学技术对病毒进行检测和鉴定。比较试剂盒和Redzol这两种dsRNA检测方法,以及研究不同处理对dsRNA提取的影响,从而建立病毒快速检测方法和体系。采用菌丝尖端分离、组织分离(原基、小菇体、菌褶)、原生质体再生、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法共6种对带毒菌株进行脱毒研究,对不同脱毒处理菌株的菌丝生长速度、生物量、单瓶产量等生物学和栽培性状进行测定,结果显示如下:1.39个金针菇品种中只在市场主栽品种F-4889、F-4891中提取到dsRNA,大小约2.0kb,透射电镜观察到病毒粒子直径大小约25nm,与已报道fvbv相似,NCBI序列比对部分基因组与fvbv相似性均达99%,证明该病毒为fvbv。2.比较两种dsRNA提取方法,发现Redzol法是一种成本低、速度快、易操作的dsRNA检测方法,尤其其检测成本是试剂盒法的1/10倍,适于普通实验室和食用菌生产企业使用;优化dsRNA提取方法—Redzol法,从而建立病毒快速检测体系。3.对6种脱毒方法的脱毒效果进行比较,结果表明:组织分离法、原生质体再生法均未能获得脱毒菌株,而菌丝尖端分离、原生质体单核化、有性生殖和核迁移法均可得到脱毒菌株,脱毒率分别为25.0%、7.5%、57.5%、100%;以上脱毒菌株的获得推测fvbv存在细胞质中,而非细胞核内;携带fvbv菌株可将病毒垂直传播给担孢子;在杂交过程中,携带fvbv菌株细胞内的病毒未能随着寄主细胞核的迁移水平传播给无毒菌丝。4.不同脱毒处理菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等测定结果表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株与原菌株、未脱毒菌株相比均有所增加,PMH、NM脱毒菌株达到显著差异水平,但TIPS未达到显著水平;栽培实验表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株发菌时间、形成原基时间和子实体发育期均短于带毒菌株,且单瓶产量、菌柄直径大于带毒菌株,也达到显著性差异,而脱毒菌株之间无显著差异,推测fvbv的存在对金针菇生长发育有一定抑制作用;有性生殖法和核迁移法脱毒应用分别获得了 8株、107株脱毒菌株,并从中选出7株无毒优良株系。综上所述,在国内主栽金针菇菌种中检测到fvbv,为了尽早避免潜在的危害,可利用Redzol法对市场上的品种进行大规模的病毒检测,及时剔除携带病毒的生产用种,针对带病毒但菌种性状优良的菌种根据不同的目的、用途采用不同的脱毒方法,为栽培生产提供无毒优质菌种,促进我国金针菇产业健康稳定发展。

关键词：金针菇 dsRNA fvbv 脱毒核迁移

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主栽金针菇品种中病毒的快速检测和鉴定

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中国农学通报 2015年第6期31卷 234-240页

作者：张俊玲章炉军谭琦尚晓冬上海市农业科学院食用菌研究所/国家食用菌工程技术研究中心上海201403 南京农业大学生命科学学院南京210095

为了探索一种成本低、速度快、易操作、特异性强的dsRNA提取方法来检测金针菇中的病毒,并对目前主栽金针菇品种进行病毒的快速检测和鉴定。以各地主栽的金针菇品种为主要研究材料,采用试剂盒法和Redzol法2种方法检测dsRNA,将这2种方法... 详细信息

为了探索一种成本低、速度快、易操作、特异性强的dsRNA提取方法来检测金针菇中的病毒,并对目前主栽金针菇品种进行病毒的快速检测和鉴定。以各地主栽的金针菇品种为主要研究材料,采用试剂盒法和Redzol法2种方法检测dsRNA,将这2种方法进行比较,并通过反转录PCR和测序确定病毒种类。结果表明,试剂盒法和Redzol法均在主栽金针菇品种F-4889和F-4891菌丝体中检测到fvbv的病毒组分。与试剂盒法相比,Redzol法检测时间短,样品需求量小,易操作,成本较低,不需要繁琐的前期准备工作,适于实验室和大中型食用菌生产企业使用。Redzol法能从金针菇菌丝体中准确提取dsRNA病毒组分,并在主栽品种F-4889和F-4891菌丝体中成功检测到fvbv的病毒组分,为栽培生产、优化市场种质资源、育种选材等提供了理论依据。

关键词：金针菇 Redzol dsRNA 反转录PCR fvbv

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金针菇病毒dsRNA检测及脱毒方法研究

金针菇病毒dsRNA检测及脱毒方法研究

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中国菌物学会2015年学术年会

作者：张俊玲章炉军谭琦尚晓冬上海市农业科学院食用菌研究所国家食用菌工程技术研究中心南京农业大学生命科学学院

本研究利用dsR NA技术、透射电镜、反转录PCR（RT-PCR）等分子生物学和病毒学技术对金针菇（Flammunlina velutipes）品种进行了病毒检测、鉴定及脱毒研究。结果显示如下:1.39个金针菇品种中只在市场主栽品种F-4889、F-4891中提取到dsR ... 详细信息

本研究利用dsR NA技术、透射电镜、反转录PCR（RT-PCR）等分子生物学和病毒学技术对金针菇（Flammunlina velutipes）品种进行了病毒检测、鉴定及脱毒研究。结果显示如下:1.39个金针菇品种中只在市场主栽品种F-4889、F-4891中提取到dsR NA,大小约2.0kb,透射电镜观察到病毒粒子直径大小约25nm,与已报道FvB V相似,NCBI序列比对部分基因组与FvB V相似性均达99%,证明该病毒为FvB V。2.对6种脱毒方法的脱毒效果进行比较,结果表明:组织分离法、原生质体再生法均未能获得脱毒菌株,而菌丝尖端分离（TIPS）、原生质体单核化（PMH）、有性生殖和核迁移法（NM）均可得到脱毒菌株,脱毒率分别为25.0%、7.5%、57.5%、100%;以上脱毒菌株的获得推测FvB V存在细胞质中,而非细胞核内;携带FvB V菌株可通过有性生殖将病毒垂直传播给担孢子;在双单杂交过程中,携带FvB V菌株细胞内的病毒未能随着寄主细胞核的迁移水平传播给无毒菌丝。不同脱毒处理菌株菌丝生长速度、生物量、漆酶活力等测定结果表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株与原菌株、未脱毒菌株相比均有所增加,PMH、NM脱毒菌株达到显著差异水平,但TIPS未达到显著水平;栽培实验表明:TIPS、PMH、NM脱毒菌株发菌时间、形成原基时间和子实体发育期均短于带毒菌株,且单瓶产量、菌柄直径大于带毒菌株,也达到显著性差异,而脱毒菌株之间无显著差异。

关键词：金针菇 dsRNA fvbv 脱毒核迁移

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