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fl118通过调控CIP2A/PP2A信号通路诱导结肠癌凋亡的机制研究

FL118通过调控CIP2A/PP2A信号通路诱导结肠癌凋亡的机制研究

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作者：林雪竹青岛大学

学位级别：硕士

目的fl118是通过高通量筛选(HTS)化合物库得到的一种高效、低毒、抗耐药性强的新型喜树碱类抗癌药物。我们的前期研究表明,fl118能够通过抑制肿瘤细胞生长以及促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,但其作用机制尚未明确。本课题旨在探讨fl11... 详细信息

目的fl118是通过高通量筛选(HTS)化合物库得到的一种高效、低毒、抗耐药性强的新型喜树碱类抗癌药物。我们的前期研究表明,fl118能够通过抑制肿瘤细胞生长以及促进肿瘤细胞凋亡发挥抗肿瘤作用,但其作用机制尚未明确。本课题旨在探讨fl118对人结肠癌的抗肿瘤效果及其作用机制。方法(1)细胞实验。首先检测fl118对人结肠癌细胞(HCT116和SW480)的抗肿瘤作用。应用不同浓度(1、2、5、10、20、50和100 nM)fl118处理结肠癌细胞48小时后,通过CCK-8实验检测fl118对结肠癌细胞活力的影响,同时对fl118的应用浓度进行优化。应用优化浓度的fl118处理结肠癌细胞48小时后,通过克隆形成实验检测fl118对结肠癌细胞增殖的影响;利用光学显微镜观察fl118对结肠癌细胞形态的影响;通过Hoechst–PI染色实验和Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测fl118对结肠癌细胞凋亡的影响;通过WB实验检测凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP、Bax和Bcl-2的表达情况,从而检验fl118对结肠癌细胞凋亡的影响。为了进一步研究fl118发挥抗肿瘤作用的机制,应用fl118处理结肠癌细胞HCT116后,通过ITRAQ技术对其中的差异表达蛋白进行分析,发现fl118能够下调结肠癌细胞中CIP2A蛋白的表达水平。为了验证fl118对CIP2A表达水平的调控作用,应用优化浓度的fl118处理结肠癌细胞48小时后,通过qRT-PCR实验检测fl118对CIP2A的mRNA表达水平的影响;通过WB实验检测fl118对CIP2A的蛋白表达水平的影响。已知CIP2A作为PP2A的内源性抑制剂,其发挥作用的经典机制是抑制PP2A活性。为了进一步确认fl118通过调控CIP2A表达水平发挥作用的机制,应用PP2A磷酸酶活性测定实验检测fl118对结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的影响,同时应用WB实验检测fl118对结肠癌细胞中PP2Ac蛋白表达水平的影响。利用R语言对TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据进行分析,从而了解CIP2A基因在结肠癌中的表达情况;应用qRT-PCR实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A的mRNA在结肠癌中的表达情况;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解CIP2A蛋白在结肠癌中的表达情况及其与结肠癌的关系,确认CIP2A能否作为本研究的目标蛋白。为了进一步验证fl118通过调控CIP2A表达水平发挥抗肿瘤作用,将PP2A抑制剂OA与fl118联合应用处理结肠癌细胞,按照处理情况将细胞分为四组:对照组、OA组、fl118组以及OA+fl118组。通过PP2A磷酸酶活性测定实验检测各组结肠癌细胞中PP2A磷酸酶活性的变化,同时通过WB实验检测PP2Ac蛋白表达水平的变化;通过CCK-8实验检测结肠癌细胞活力的变化,并通过流式细胞术实验以及WB实验检测结肠癌细胞凋亡的变化。(2)动物实验。利用结肠癌细胞HCT116对小鼠进行皮下注射,构建肿瘤异体移植模型。将实验动物分成空白对照组、低浓度实验组(4 mg/kg/week)和高浓度实验组(8 mg/kg/week),各组实验动物采用灌胃方式给予相应剂量的fl118溶液。实验结束后,取出肿瘤,将小鼠的肿瘤组织以及主要组织(心、肝、脾、肺、肾、大脑)进行包埋保存。通过测量不同组别小鼠皮下肿瘤相对体积及重量来研究fl118对移植瘤体内生长的作用;通过TUNEL-DAPI染色实验检测fl118在动物水平对结肠癌凋亡的影响;通过HE染色实验检测fl118对移植瘤组织病理学的影响;通过免疫组化实验检测fl118对体内结肠癌凋亡及CIP2A蛋白表达水平的影响。通过测量不同组别小鼠体重的变化、对小鼠主要器官的组织切片进行HE染色、检测小鼠肝肾功能指标以及血常规检测实验对fl118的耐受性做出初步评价。结果(1)细胞实验。应用不同浓度(1、2、5、10、20、50和100 nM)fl118处理结肠癌细胞48小时后,CCK-8实验结果表明,fl118能够显著降低结肠癌细胞的活力,另将10 nM和20 nM选为后续实验浓度。应用优化浓度(10 nM和20 nM)fl118处理结肠癌细胞48小时后,克隆形成实验结果表明,fl118能够显著降低结肠癌细胞的增殖能力;细胞形态学观察实验的结果表明,fl118能显著影响结肠癌细胞形态,使其呈现凋亡趋势;Hoechst–PI染色实验以及流式细胞术结果表明,fl118能够显著诱导结肠癌细胞的凋亡,并具有剂量依赖性;在WB结果中,凋亡标志性蛋白Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP的表达水平随fl118浓度的升高而显著上升,而Bcl-2/B

关键词： fl118 结肠癌细胞凋亡 CIP2A PP2A

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fl118水溶性新衍生物的设计合成和活性研究

FL118水溶性新衍生物的设计合成和活性研究

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作者：夏利华浙江工业大学

学位级别：硕士

fl118是一种新型的喜树碱衍生物,是美国Roswell Park癌症研究所在以Survivin基因作为目标和生存标志物的基因工程癌症细胞模型中,通过计算机高通量筛选(HTS)得到的抗肿瘤活性化合物。研究发现fl118对多种癌细胞显示出强大的抑制活性,制... 详细信息

fl118是一种新型的喜树碱衍生物,是美国Roswell Park癌症研究所在以Survivin基因作为目标和生存标志物的基因工程癌症细胞模型中,通过计算机高通量筛选(HTS)得到的抗肿瘤活性化合物。研究发现fl118对多种癌细胞显示出强大的抑制活性,制剂改造后的fl118在小鼠体内的抑瘤效果是已上市喜树碱类药物伊立替康和拓扑替康的1000倍,对伊立替康和拓扑替康耐药的肿瘤细胞亦有显著的抑制效果,而且fl118对机体毒性较低。但是fl118母核分子仍存在水溶性差、内酯环不稳定、生物利用度低的缺陷。近年来前药的设计应用越来越广泛,前药既保持或增强了原药的药效,又克服了原药的某些缺点。本文针对fl118的上述缺陷,以增强水溶性、提高内酯环的稳定性为目标,对fl118开展前药结构设计,以水溶性的氨基酸为配基对fl118的20(S)-位进行偶联形成水溶性前药,并评价新衍生物的抗肿瘤活性,探索高效、低毒的水溶性fl118抗肿瘤前药。(1)fl118氨基酸酯前药的设计合成基于课题组前期对fl118构效关系的考察结果,将课题计划设计合成的fl118氨基酸酯前药与其作用靶点人的Survivin蛋白基因1XOX进行分子对接模拟,通过调整对接方法和参数,得出设计合成的fl118氨基酸酯前药与靶向蛋白之间的结合方式及结合紧密程度,为后续化合物的抗肿瘤活性筛选提供理论参照。参照课题组前期针对fl118衍生物的设计合成方法,以6-硝基胡椒醛、三环酮内酯和L型Boc保护的氨基酸为原料,设计并优化目标产物的合成路线,经过还原、Friedlander缩合、酯化和脱保护基反应,共合成10个不同性质类型、未见文献报道的fl118氨基酸酯前药,通过H NMR和C NMR方法确定了结构,总产率为20%2%,产物纯度大于98%。(2)fl118氨基酸酯前药的生物稳定性和活性研究以原药fl118为阳性对照,开展fl118氨基酸酯前药6aj体外稳定性的考察,包含PBS缓冲液和人血浆中的稳定性实验,发现原药fl118和其氨基酸酯前药具有不同的生物稳定性,其中化合物6a的生物稳定性最差,在PBS及人血浆中的半衰期只有0.6 h和0.3 h,化合物6f稳定性最好,半衰期分别为13.3 h和6.1 h,实验还发现,合成的前药6aj在孵育过程中不断降解释放出fl118原药,可见fl118的酯前药具有很好的水溶性,在生物体媒介中能不断释放fl118,有助于增加fl118原药的生物利用度和在体内的停留时间,有效的延长药物的半衰期。采用MTT法对合成的fl118氨基酸酯前药的细胞毒进行评价,发现这些化合物在四种肿瘤细胞系中均表现出良好的抗肿瘤活性,其中化合物6b对HCT116的IC值达到0.025μM,与阳性对照fl118极为接近。通过异种移植的结肠癌裸鼠模型实验考察化合物6c、6i和6j的体内抗肿瘤活性,发现化合物在8 mg/kg的给药剂量下均能产生有效的抗肿瘤活性,其中化合物6c和6j虽然表现的抗肿瘤活性不如原药fl118,但是它们的毒性相较fl118更低,可以考虑后续通过提高剂量的手段提升其体内抗肿瘤效果。总之,论文设计合成的10个fl118氨基酸酯前药6aj,具有很好的水溶性,在生物体媒介中能不断释放fl118,提升了fl118原药的生物利用度,有效的延长药物在生物体内的半衰期,动物实验的体内毒性较fl118明显降低,同时表现出有效的抗肿瘤活性,论文为该类化合物的进一步研发提供依据。

关键词： fl118 氨基酸酯前药抗肿瘤异植瘤模型活性筛选

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喜树碱类似物fl118诱导结肠癌细胞焦亡及抑制其生长和转移的机制研究

喜树碱类似物FL118诱导结肠癌细胞焦亡及抑制其生长和转移的机制...

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作者：唐振雪青岛大学

学位级别：硕士

目的细胞焦亡作为一种新发现的炎症性程序性细胞死亡,目前在机制研究方面与结直肠癌的相关性研究较浅。同时,相关研究证实,fl118对结肠癌的生长和转移有显著的抑制作用,但其与细胞焦亡的关系机制尚未研究。本研究主要探讨fl118是否通... 详细信息

目的细胞焦亡作为一种新发现的炎症性程序性细胞死亡,目前在机制研究方面与结直肠癌的相关性研究较浅。同时,相关研究证实,fl118对结肠癌的生长和转移有显著的抑制作用,但其与细胞焦亡的关系机制尚未研究。本研究主要探讨fl118是否通过细胞焦亡影响结肠癌的抗肿瘤作用。方法首先检测细胞焦亡基因Caspase-1在结肠癌组织中的表达情况。通过生物信息学方法分析TCGA数据库中结肠癌相关的基因数据,从而了解Caspase-1基因在结肠癌中的表达情况;应用免疫组化实验对结肠癌患者的临床样本进行分析,从而了解Caspase-1蛋白在结肠癌中的表达情况以及与结肠癌的相关性。其次,检测fl118对人结肠癌细胞（HT29和SW480）的抗肿瘤作用。应用MTT实验检测fl118对结肠癌细胞活力的影响;应用划痕和Transwell实验检测fl118对结肠癌细胞迁移和侵袭的影响。为了探索细胞焦亡在fl118发挥抗肿瘤作用中的角色,通过光学显微镜观察细胞形态学变化,进一步应用TUNEL实验证明细胞死亡的现象,辅助LDH释放实验验证细胞焦亡的发生。为了进一步在机制上验证Caspase-1介导的细胞焦亡通路对于fl118抗肿瘤的作用,通过qRT-PCR实验以及Western Blot和免疫荧光实验分别在mRNA水平和蛋白水平检测fl118对Caspase-1及下游标志基因IL-18、IL-1β表达的影响;并通过Elisa试剂盒辅助确认fl118处理的细胞上清中IL-18、IL-1β蛋白的表达情况。最后,通过使用Caspase-1的特异性抑制剂VX-765,应用MTT实验筛选出合适的作用浓度和作用时间,在此基础上,应用LDH释放实验检测VX-765对fl118作用于结肠癌打孔能力的影响;在mRNA水平上,VX-765对Caspase-1、IL-18和IL-1β表达的影响通过应用qRT-PCR实验检测;VX-765对Caspase-1及IL-18和IL-1β蛋白表达的影响通过应用Western Blot分析、免疫荧光实验检测;通过Elisa实验辅助验证VX-765对IL-18和IL-1β蛋白表达的影响;最后,我们通过划痕和Transwell实验验证VX-765对fl118作用于结肠癌的迁移和侵袭的影响。从而证明在体外水平细胞焦亡参与了fl118抑制结肠癌细胞生长和转移的作用。重要的是,我们通过皮下注射HCT116细胞构建肿瘤异体移植模型,尾静脉注射HT29细胞构建肺转移模型。实验设置三组:空白对照组、低浓度实验组（4 mg/kg/week）和高浓度实验组（8 mg/kg/week）,灌胃给与不同剂量的fl118溶液,并定期测量异体移植模型小鼠体重及其瘤重变化。实验结束后,异体移植模型小鼠的肿瘤组织及各脏器（心、肝、脾、肺、肾、大脑）冰冻切片,肺转移模型小鼠的肺组织进行包埋保存,应用HE染色实验检测fl118对小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑的形态学影响及肺表面肺结节的影响;在动物水平上,fl118对结肠癌死的影响应用TUNEL-DAPI染色实验进行检测;应用免疫组化实验检测fl118对体内结肠癌细胞焦亡相关蛋白的影响。从而在体内水平证明fl118诱导细胞焦亡抑制结肠癌的生长和转移。结果生物信息学统计分析显示caspase-1的表达水平与结肠癌的发生成负相关性,在正常结肠样本中的表达显著高于结肠癌样本;免疫组化实验结果均显示Caspase-1蛋白在癌旁组织中的表达量均高于结肠癌组织。细胞实验结果如下所述,MTT实验结果表明fl118以剂量依赖性明显降低结肠癌细胞的活力,但正常结肠上皮细胞对fl118不敏感;划痕实验和Transwell实验结果表明随着fl118浓度的升高,细胞划痕的距离及Transwell小室中细胞数减少,即细胞迁移和侵袭的能力逐渐降低。此外,显微镜下观察到细胞膜肿胀,甚至破裂导致膜内容物流出的典型细胞焦亡形态学特征,TUNEL染色实验和LDH释放实验结果显示fl118处理组较对照组细胞死亡数显著增加和LDH释放率增加,进一步证明了细胞焦亡现象的发生。重要的是,细胞焦亡关键蛋白GSDMD的表达随着药物浓度升高的现象佐证了细胞焦亡现象的存在。qRT-PCR实验结果表明随着药物浓度的升高,细胞焦亡相关基因的表达均出现了明显的上升;在蛋白水平上,Western Blot实验和免疫荧光实验的检测结果与mRNA水平一致,然后Elisa实验结果证明分泌型蛋白IL-18、IL-1β的表达随fl118浓度的升高而升高。在MTT实验中,当fl118与VX-765共培养时,其细胞活力显著高于单独fl118组;LDH实验结果和GSDMD因子表达结果显示VX-765削弱了fl118对结肠癌细胞的打孔能力;在mRNA和蛋白水平结果均表明相比较于fl118单独用药组,fl118

关键词： fl118 细胞焦亡结肠癌生长转移

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新型喜树碱类似物fl118对顺铂耐药非小细胞肺癌抑制作用的研究

新型喜树碱类似物FL118对顺铂耐药非小细胞肺癌抑制作用的研究

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作者：张丹丹青岛大学

学位级别：硕士

目的:通过观察新型喜树碱类似物fl118对顺铂耐药非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的增殖、迁移和顺铂耐药的抑制作用,探讨fl118对抗耐顺铂肿瘤细胞的作用机制,为fl118临床治疗顺铂耐药肺癌提供理论支持。方法:常规培养人非小细胞肺癌细胞系A54... 详细信息

目的:通过观察新型喜树碱类似物fl118对顺铂耐药非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的增殖、迁移和顺铂耐药的抑制作用,探讨fl118对抗耐顺铂肿瘤细胞的作用机制,为fl118临床治疗顺铂耐药肺癌提供理论支持。方法:常规培养人非小细胞肺癌细胞系A549和其顺铂耐药细胞A549/DDP,通过MTT法检测A549/DDP的耐药指数、免疫细胞化学方法检测耐药蛋白P-gp、ERCC1的表达,从而验证A549/DDP细胞的顺铂耐药性。实验分组:A549组,A549/DDP组,A549顺铂处理组,A549/DDP顺铂处理组,A549+fl118处理组,A549/DDP+fl118处理组。MTT法检测各组细胞存活率;细胞划痕实验与Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭能力;实时荧光定量PCR、免疫细胞化学和Western blot方法分别检测耐药相关蛋白P-gp、ERCC1、上皮间质转化(EMT)免疫标志E-cadherin、Vimentin以及Survivin的m RNA和蛋白的表达;流式细胞术检测细胞周期变化。结果:1.与A549细胞相比,A549/DDP细胞形态呈长梭形、排列呈旋涡状或放射状,类似纤维细胞;MTT检测A549/DDP耐药指数为76.9(pfl118对A549/DDP细胞的生长有明显抑制作用,且抑制作用呈现时间和浓度依赖性,100n M fl118作用48h后对A549/DDP细胞抑制作用显著强于A549细胞(pfl118作用后肺癌细胞的迁移能力下降(pfl118明显抑制肿瘤细胞的侵袭能力(pfl118作用后,耐药细胞中Survivin表达降低,并且耐药蛋白P-gp、ERCC1表达也明显降低;E-cadherin表达增强,Vimentin表达下降。5.实时荧光定量PCR结果显示,fl118可抑制Survivin基因表达,但对耐药相关基因MDR1/P-gp、ERCC1无抑制作用,而E-cadherin、Vimentin m RNA的表达与蛋白表达结果相一致。6.流式细胞术检测fl118作用后,A549及A549/DDP细胞均阻滞在S期(Pfl118通过靶向抑制Survivin的表达,使顺铂耐药A549/DDP细胞周期被阻滞在S期,抑制耐药细胞的生长,且其抑制作用呈浓度-时间依赖性;fl118不仅明显抑制顺铂耐药细胞的运动侵袭能力,而且可以通过下调耐药相关蛋白表达增强耐药细胞对fl118的敏感性,进一步明确了fl118较强的对抗耐药和侵袭性肿瘤作用。同时,fl118可以逆转耐药细胞的上皮间质转化表型,提示fl118对抗耐药性肿瘤作用机制新的思路。本研究为fl118抗癌机制的研究提供新思考,也为fl118临床治疗顺铂耐药性肺癌提供理论依据。

关键词： fl118 顺铂耐药非小细胞肺癌 Survivin 上皮间质转化

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喜树碱结构类似物fl118对人卵巢癌的抑制作用及机制研究

喜树碱结构类似物FL118对人卵巢癌的抑制作用及机制研究

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作者：赵洪芹青岛大学

学位级别：硕士

目的:fl118是一种新型喜树碱结构类似物。前期研究发现,fl118能明显拮抗结肠癌、头颈癌及非小细胞肺癌等恶性肿瘤的进展和复发。差异蛋白组学分析技术检测fl118(0/100 nM)处理结肠癌细胞系HCT-116 72 h后,发现fl118能明显升高肿瘤抑制... 详细信息

目的:fl118是一种新型喜树碱结构类似物。前期研究发现,fl118能明显拮抗结肠癌、头颈癌及非小细胞肺癌等恶性肿瘤的进展和复发。差异蛋白组学分析技术检测fl118(0/100 nM)处理结肠癌细胞系HCT-116 72 h后,发现fl118能明显升高肿瘤抑制蛋白胞红蛋白(CYGB)的表达水平。但是fl118对卵巢癌的作用及相关机制尚不明确。该项目旨在在体内、外考察fl118对卵巢癌的抗肿瘤活性,并靶向CYGB进一步探讨fl118抗卵巢癌增殖和迁移作用的分子机制。方法:细胞水平,选人卵巢癌细胞系ES-2和SK-O-V,首先采用MTT法和划痕实验检测fl118对卵巢癌细胞系增殖和迁移能力的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫印迹杂交(Western Blot)技术检测fl118(0/10/100 nM)处理48 h,对卵巢癌细胞中CYGB在mRNA和蛋白表达水平的影响;采用si-RNA干扰方法下调CYGB表达后转染卵巢癌细胞,fl118(100 nM)处理48/24 h后,MTT法和划痕实验再次检测CYGB下调后,fl118对卵巢癌细胞增殖和迁移能力的影响。动物水平,皮下接种卵巢癌ES-2细胞建立裸鼠异种移植瘤模型,待瘤块体积长到100-200mm时,随机分为4组:溶剂对照组,fl118组(5 mg/kg),fl118组(10 mg/kg),拓扑替康组(2 mg/kg)。采用灌胃的方式给予fl118(5mg/kg、10 mg/kg),每周给药1次,连续给药20天,期间每隔1天记录裸鼠的体重和肿瘤的体积。当肿瘤体积大于1500mm或者濒临死亡时,处死裸鼠取瘤块,称量瘤块的重量以及检测不同组别瘤块中CYGB mRNA和蛋白水平的表达量。结果:细胞水平,fl118能明显抑制卵巢癌细胞ES-2和SK-O-V的增殖(pfl118(10/100 nM)干预卵巢癌细胞48 h后能明显上调卵巢癌细胞ES-2和SK-O-V中CYGB的mRNA和蛋白水平;下调CYGB后,fl118(100 nM)处理48/24 h后,对卵巢癌细胞ES-2和SK-O-V3的增殖(pfl118组/拓扑替康组肿瘤细胞生长速度缓慢,瘤块体积及重量均明显减小(Pfl118组裸鼠皮下接种瘤块的生长速度要慢于拓扑替康组。更重要的是,第20天时,fl118处理(10mg/kg)组,60%裸鼠的肿瘤基本消失;fl118(5 mg/kg)组,溶剂对照组,拓普替康组这三组之间的体重差异并没有统计学意义(p>0.05)。然而,fl118处理(10 mg/kg)组与溶剂对照组相比,体重下降,并且差异有统计学意义(pfl118处理组CYGB表达量在m RNA和蛋白水平均上调。结论:细胞水平,fl118能够显著抑制卵巢癌ES-2和SK-O-V细胞的增殖和迁移能力;fl118通过上调CYGB的表达抑制卵巢癌ES-2和SK-O-V细胞的增殖和迁移能力。动物水平,fl118能够显著抑制肿瘤细胞的生长,并且比拓扑替康抑制肿瘤生长的效应更好;但是,在fl118浓度达到10 mg/kg以后,可能由于剂量相对较高的原因,裸鼠的体重比fl118(5mg/kg)组以及空白对照组明显下降,这提示我们10 mg/kg可能对裸鼠有一定的毒性;此外,体内实验也表明fl118能上调CYGB的表达。本研究为fl118的抗肿瘤机制和其进一步的临床应用提供了新的理论基础。

关键词： fl118 卵巢癌胞红蛋白增殖迁移

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新型喜树碱类似物fl118对人非小细胞肺癌作用效果的早期研究

新型喜树碱类似物FL118对人非小细胞肺癌作用效果的早期研究

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作者：邢丽飞青岛大学

学位级别：硕士

肺癌是全球第一大致命的癌症,被人们称为“癌中之王”。根据病理类型,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的85%以上。近几年来,非小细胞肺癌的发病率和死亡率不断增高。无论是在我国还是全球,非小细胞肺... 详细信息

肺癌是全球第一大致命的癌症,被人们称为“癌中之王”。根据病理类型,肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌占所有肺癌病例的85%以上。近几年来,非小细胞肺癌的发病率和死亡率不断增高。无论是在我国还是全球,非小细胞肺癌都已成为致死率最高的肿瘤。约75%的非小细胞肺癌患者确诊时已处于中晚期。而对于中晚期或已经转移的非小细胞肺癌患者,由于失去了手术治疗的最佳时机,系统性的化疗和放疗是最主要的治疗方法。然而放疗化疗耐药以及化疗药物诱导的DNA损伤和肝肾造血系统毒性等因素极大局限了现有治疗方案的效果,患者5年生存率很低。因此,筛选具有良好作用效果、副作用少、且耐药性小的抗非小细胞肺癌药物成为当前临床研究的热点和难点。研究人员在以Survivin基因作为靶标和生物标志物筛选抗癌药物时,发现了一种新型喜树碱类似物fl118。前期研究表明,fl118高效低毒抗耐药且抗瘤谱广,是一个很有临床应用价值的候选药物。然而,fl118对非小细胞肺癌的作用效果尚未明确。本课题旨在初步探究fl118对非小细胞肺癌的作用效果,促进fl118的进一步研究和开发,为非小细胞肺癌患者的临床用药提供新的选择。研究目的研究fl118对非小细胞肺癌A549细胞和H520细胞活力、凋亡、侵袭迁移能力和EMT过程的影响,为进一步深入探讨fl118抗非小细胞肺癌机制的研究提供理论依据。研究方法应用CCK-8实验方法,检测fl118对A549和H520细胞活力的影响;用倒置相差显微镜对加药处理的A549细胞和H520细胞进行拍照,观察其形态的改变;应用Western Blot、Hoechst-PI染色实验和Annexin V-FITC双染法流式细胞术实验检测fl118对A549和H520细胞凋亡作用的影响;采用Transwell实验以及划痕实验分别检测fl118对A549细胞和H520细胞迁移侵袭能力的影响;应用Western Blot实验及免疫荧光实验分别检测fl118对A549细胞和H520细胞EMT过程标志性蛋白E-cadherin和N-cadherin表达水平的影响以及E-cadherin和N-cadherin在细胞中的转运。研究结果(1)CCK-8实验显示,A549细胞和H520细胞经不同浓度的fl118(2 nM、5 nM、10 nM、20 nM、50 nM、100 nM和200 nM)处理24 h,100 nM fl118之前,其细胞活力基本无变化。当温育时间延长至48 h,随着药物浓度的升高,fl118能显著降低A549细胞和H520细胞的细胞活力,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。形态学拍照的结果显示,不同浓度的fl118(2 nM、5 nM、10 nM和20 nM)处理A549细胞和H520细胞48 h,细胞逐渐呈现出不同程度的凋亡样特征。Western Blot的结果显示,促凋亡蛋白Bax和cleaved-PARP的表达水平随药物浓度的升高而上升,抗调亡蛋白Bcl-2及PARP的表达水平随药物浓度的升高而降低。Hoechst/PI双染法和Annexin V/PI双染法流式细胞术的实验结果进一步说明fl118可明显地诱导A549细胞发生凋亡,但对H520细胞的凋亡诱导作用较弱。在凋亡诱导效果上,两细胞存在敏感度差异。Annexin V/PI双染法流式细胞术实验中,在fl118的浓度为10 nM和20 nM时,A549细胞的平均凋亡率分别约为25%和35%,与对照组相比,均具有明显的统计学差异。在H520细胞中,相比对照组,fl118的浓度为10 nM时,平均凋亡率约为8%(相比于对照组没有统计学意义)。fl118的浓度为20 nM时,平均凋亡率约为10%(与对照度组比较,具有统计学差异)。(2)根据24 h的CCK-8实验结果,选取优化实验剂量(20 nM和50 nM)检测fl118对A549细胞和H520细胞侵袭迁移能力和EMT过程的影响。Transwell实验和划痕实验中,随着药物浓度的升高,fl118能逐渐降低A549细胞和H520细胞的侵袭迁移能力(与对照组比较,均具有明显的统计学意义)。细胞免疫荧光实验及Western Blot的实验结果显示,fl118可以明显促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin的表达,这表明fl118可明显抑制A549细胞和H520细胞的EMT过程。研究结论***118在48 h时可显著降低A549细胞和H520细胞的细胞活力,且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。***118在48 h时可明显地诱导A549细胞发生凋亡,但对H520细胞的凋亡诱导作用较弱。凋亡诱导效果上,两种细胞存在敏感度差异***118在24 h时可明显降低A549细胞和H520细胞的侵袭迁移能力和抑制其EMT过程。

关键词： fl118 非小细胞肺癌细胞凋亡侵袭转移

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喜树碱类似物fl118对人乳腺癌侵袭转移的影响及机制研究

喜树碱类似物FL118对人乳腺癌侵袭转移的影响及机制研究

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作者：刘冉冉青岛大学

学位级别：硕士

目的探讨喜树碱类似物fl118对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移能力的影响及其作用机制。方法以高转移的人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,通过细胞增殖实验(MTT)观察fl118对肿瘤细胞活性及增殖情况的影响;流式细胞仪测定肿瘤细胞周期分... 详细信息

目的探讨喜树碱类似物fl118对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移能力的影响及其作用机制。方法以高转移的人乳腺癌MDA-MB-231细胞为研究对象,通过细胞增殖实验(MTT)观察fl118对肿瘤细胞活性及增殖情况的影响;流式细胞仪测定肿瘤细胞周期分布;细胞平板克隆形成实验、划痕修复实验及Transwell侵袭实验检测fl118干预后肿瘤细胞的平板克隆形成、转移及侵袭能力变化;实时荧光定量PCR(q PCR)、免疫细胞化学(ICC)和免疫印迹杂交(Western Blot)实验检测fl118对乳腺癌细胞survivin和上皮间质转化(EMT)相关信号分子E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及Wnt信号通路核内关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)及细胞周期素1(Cyclin Dl)的m RNA和蛋白水平的表达。结果fl118对MDA-MB-231细胞有增殖抑制作用,呈现一定的量效及时效关系(Pfl118使MDA-MB-231细胞有丝分裂受阻于S期(Pfl118可降低MDA-MB-231细胞的平板克隆形成能力(Pfl118可以使MDA-MB-231细胞的转移和侵袭能力下降(Pfl118干预后,乳腺癌MDA-MB-231细胞E-Cadherin的m RNA及蛋白表达水平上升(Pfl118能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖、克隆形成能力、转移和侵袭能力,并能提高E-Cadherin表达,降低Vimentin和Survivin表达,降低核内β-catenin及Cyclin Dl的表达,初步证明fl118抑制EMT的机制与Wnt通路有关。

关键词： fl118 乳腺癌侵袭转移 EMT Wnt

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fl1189位修饰衍生物抗肿瘤活性及其机制研究

FL1189位修饰衍生物抗肿瘤活性及其机制研究

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作者：翁琦浙江工业大学

学位级别：硕士

fl118是一种具有高效抗肿瘤活性的喜树碱衍生物。fl118不仅在人结肠癌和头颈部癌中显示出优异的抗癌活性,而且对临床使用的喜树碱衍生物(伊立替康和拓扑替康)耐药的细胞株非常敏感,是非常具有潜质的抗肿瘤候选药物。fl118分子自身在有... 详细信息

fl118是一种具有高效抗肿瘤活性的喜树碱衍生物。fl118不仅在人结肠癌和头颈部癌中显示出优异的抗癌活性,而且对临床使用的喜树碱衍生物(伊立替康和拓扑替康)耐药的细胞株非常敏感,是非常具有潜质的抗肿瘤候选药物。fl118分子自身在有机相和水相中溶解性都很差,有科研工作者通过制剂的方式提高了其溶解性和生物利用度。为了寻求更高效低毒的fl118衍生物,改善其生物利用度,课题组设计合成了一系列9位修饰的fl118衍生物。通过体外抗肿瘤活性初步筛选和裸鼠体内抗肿瘤活性筛选,发现新衍生物9-Q10、9-Q18和9-Q20具有较优的抗肿瘤活性。本论文将针对上述3个新衍生物的生物学性质和抗肿瘤机制展开深入研究。目的:一方面,本文通过2D和3D细胞模型评估fl118和9-Q20的细胞毒性和细胞摄取的差异,预测9位修饰的fl118衍生物较其母核化合物在生物体内的吸收情况是否有改善。另一方面,通过细胞生物学和分子生物学手段研究fl118、9-Q10、9-Q18和9-Q20对HCT116细胞增殖、转移以及凋亡的影响,探讨上述化合物的作用机制,为后续fl118新衍生物的研发提供实验依据。方法:首先,采用MTT法研究fl118、9-Q10、9-Q18和9-Q20对MCF-7、A549、HCT116、HeLa和HepG2等5种癌细胞的增殖抑制活性。其次,建立和优化3D Caco-2细胞模型和用于fl118和9-Q20的含量测定的HPLC分析方法;利用2D与3D细胞模型考察fl118和9-Q20给药浓度、孵育时间、温度和转运蛋白抑制剂对细胞摄取的影响,考察药物在不同细胞系中的摄取差异。最后,采用MTT法、细胞划痕法、Hoechst 33258荧光染色法、DCFH-DA探针法以及Caspases活性试剂盒测定法研究fl118、9-Q10、9-Q18和9-Q20对HCT116细胞增殖、迁移以及凋亡的影响;通过Western blot法对HCT116细胞中的XIAP、Mcl-1、Survivin、Akt、p-Akt、Cyt-c、Bcl-2和Bax等凋亡相关蛋白水平进行检测,探索9位修饰的fl118新衍生物诱导HCT116细胞凋亡的机制。结果:(1)建立和优化了3D Caco-2细胞球体模型,在接种密度为2.5×10个细胞/mL,孵育时间为72 h时,Caco-2细胞已经形成了比较紧密和大小均一的3D球状体,且细胞活力大于90%。72 h MTT实验结果显示fl118和9-Q18均在nM水平有效地抑制了这5种癌细胞的增殖;fl118和9-Q20均显著抑制了HCT116的增殖,但是对于HepG2的抑制作用相对稍弱。8 h的MTT实验结果表明0.1-1μM fl118和9-Q20与Caco-2、HCT116和HepG2细胞作用8 h后,无明显的细胞毒性,且3D细胞模型中的细胞活力大于2D细胞模型的细胞活力。(2)2D和3D Caco-2细胞模型对fl118和9-Q20的摄取均呈现出时间和浓度依赖性,且2D和3D细胞模型对9-Q20的摄取量均高于fl118。在孵育早期,2D Caco-2细胞模型摄取fl118和9-Q20的速率更快。随着时间的推移,3D Caco-2细胞模型摄取fl118和9-Q20的能力不断提高,摄取量不断增大。外排泵蛋白P-gp和BCRP可降低9-Q20在2D和3D Caco-2细胞模型中的积累,这说明9-Q20的细胞摄取量和P-gp、BCRP外排泵蛋白有关。在维拉帕米(P-gp抑制剂)或易瑞沙(BCRP抑制剂)处理过的2D和3D Caco-2细胞模型中,3D Caco-2细胞模型对9-Q20的摄取明显增加。然而,P-gp和BCRP对fl118在2D和3D Caco-2细胞模型中的积累没有影响,这说明fl118的细胞摄取量和P-gp、BCRP外排泵蛋白无关。虽然2D和3D HepG2细胞模型对fl118和9-Q20的摄取量均高于HCT116细胞模型,但是fl118和9-Q20却体现出更显著地抑制HCT116细胞的增殖活性。(3)将fl118、9-Q10、9-Q18和9-Q20与HCT116细胞孵育后,HCT116细胞核发生了不同程度的皱缩,细胞内ROS水平升高以及Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性升高,这些结果表明fl118和9-Q10、9-Q18和9-Q20均诱导HCT116细胞凋亡。此外,细胞划痕实验表明fl118和9-Q10、9-Q18和9-Q20抑制了HCT116细胞的迁移。Western blot实验结果表明fl118和9-Q10、9-Q18和9-Q20均不同程度地降低了HCT116细胞中XIAP、Mcl-1以及Survivin的表达。fl118和9-Q18均降低了HCT116细胞中p-Akt、Akt和Bcl-

关键词： fl118 3D细胞模型细胞摄取细胞凋亡

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A Novel Camptothecin Analogue Inhibits Colon Cancer Development and Downregulates the Expression of MiR-155 in Vivo and in Vitro

A Novel Camptothecin Analogue Inhibits Colon Cancer Developm...

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作者：林倩青岛大学

学位级别：硕士

目的研究新型喜树碱类似物fl118对结肠癌的抑制作用特点,尝试从表观遗传学(micro RNA)角度寻找fl118抗癌作用的新靶标,解释fl118作用优于其他喜树碱类药物的作用机制。方法选择结肠癌细胞系HCT-116作为实验研究对象。MTT实验选取一系列... 详细信息

目的研究新型喜树碱类似物fl118对结肠癌的抑制作用特点,尝试从表观遗传学(micro RNA)角度寻找fl118抗癌作用的新靶标,解释fl118作用优于其他喜树碱类药物的作用机制。方法选择结肠癌细胞系HCT-116作为实验研究对象。MTT实验选取一系列梯度的fl118(0.01/0.1/1/10/100/1000 n M)处理HCT-116细胞72h,选择SN38(100 n M)为阳性对照药。实验结束后在酶标仪上490 nm波长处检测OD值,用T检验(Student’s t test)检测实验处理组与空白对照组之间的细胞活力的差异。划痕实验选取fl118的剂量为10 n M。分别在0/24/48h时在显微镜下观察划痕的宽度变化,拍照记录HCT-116细胞迁移能力的变化。Brd U增殖实验选取fl118的剂量为10 n M,fl118作用于HCT-116细胞24h。Brd U试剂在fl118作用结束前2.5h时加入到细胞培养液中。之后在酶标仪上波长450 nm处检测OD值,用T检验(Student’s t test)检测实验处理组与空白对照组之间的细胞增殖能力的差异。流式细胞术检测fl118(10 n M)作用后HCT-116细胞的周期分布和凋亡情况。采用PI单染的方法来检测细胞周期。在fl118作用前12h,饥饿细胞以使周期同步化。实验结束后收集细胞,固定、染色,经400目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测。Motif软件分析细胞周期分布情况。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。fl118作用于HCT-116细胞12/24/36h后,收集细胞,用Annexin V-FITC/PI染色,经400目尼龙网过滤后上流式细胞仪检测。用四象限法统计正常、早期凋亡、晚期凋亡、死亡和机械性坏死的细胞所占的百分比,计算凋亡率。通过构建裸鼠移植瘤模型观察fl118对结肠癌瘤体生长的影响。采用皮下注射的方法在BALB/c雌性裸鼠上接种HCT-116细胞。fl118采用瘤内注射,选取两个剂量:0.75 mg/kg和1.5 mg/kg。每周给药一次,持续四周,然后停药一周,是为一个给药周期。每隔一天记录裸鼠体重和肿瘤体积的变化。直到在体肿瘤的体积大于1500 mm3,实验结束,处死小鼠,收集肿瘤组织,并于液氮中保存。通过荧光定量PCR检测fl118作后结肠癌细胞(HCT-8、HCT-116)和移植瘤组织中mi R-155的表达量变化。fl118作用于结肠癌细胞的剂量为1/10/100 n M,作用时间为24/48h。反应结果用CFX ManagerTMSoftware进行分析。用T检验(Student’s t test)检测实验处理组与空白对照组之间的细胞中mi R-155表达水平的差异。结果fl118可有效抑制结肠癌细胞的活力、迁移和增殖能力,导致细胞周期阻滞在S期,并促进细胞凋亡。fl118还可明显抑制在体肿瘤的生长。无论是体内还是体外实验,在fl118作用后都在结肠癌细胞和移植瘤组织检测到了mi R-155的表达水平明显下调(pfl118在体内体外均可抑制结肠癌生长并明显下调结肠癌细胞和组织中mi R-155的表达。鉴于mi R-155在结肠癌发生和发展过程中的促癌作用,进一步深入研究mi R-155在fl118发挥高效低毒抗结肠癌作用中可能扮演的重要角色对促进新的抗癌靶标研究及新药开发具有很高的理论与临床意义。

关键词： fl118 miR-155 结肠癌新型喜树碱类似物

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