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fitc标记的抗Brdu单克隆抗体的研制

细胞与分子免疫学杂志 2000年第2期16卷 164-165页

作者：徐志伟邓鸿业韩淑红邓玉兰黄大无丁桂凤北京医科大学免疫学系北京100083

利用溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)作为胸苷类似物可掺入到新合成的DNA中的特点,通过检测Brdu标记的细胞便能定性、定量地反映细胞的增殖状态[1].我们已筛选出分泌特异性抗Brdu单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株[2].为制备荧光素标记的抗BrdumAb用... 详细信息

利用溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)作为胸苷类似物可掺入到新合成的DNA中的特点,通过检测Brdu标记的细胞便能定性、定量地反映细胞的增殖状态[1].我们已筛选出分泌特异性抗Brdu单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株[2].为制备荧光素标记的抗BrdumAb用于流式细胞术定量检测增殖细胞,参考有关文献,用亲和层析纯化小鼠IgG亚类的方法,从腹水中纯化了抗BrdumAb,并用fitc荧光素进行标记.经初步用于体外检测Brdu标记细胞的数量,取得较好的结果.

关键词： Brdu 单克隆抗体亲和纯化 fitc标记增殖细胞

fitc示踪在优化小麦花粉管通道转化方法中的应用

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西北植物学报 2008年第3期28卷 611-616页

作者：仇泽苏乔安利佳大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系辽宁大连116024

利用fitc(fluorescein is othiocyanate,异硫氰酸荧光素)标记的外源DNA对小麦进行了花粉管通道法转化,在荧光显微镜下观察了外源DNA进入小麦胚囊的情况,并初步研究了转化时间及转化溶液组成对DNA进入胚囊效率的影响。结果表明,外源DNA... 详细信息

利用fitc(fluorescein is othiocyanate,异硫氰酸荧光素)标记的外源DNA对小麦进行了花粉管通道法转化,在荧光显微镜下观察了外源DNA进入小麦胚囊的情况,并初步研究了转化时间及转化溶液组成对DNA进入胚囊效率的影响。结果表明,外源DNA沿着花粉管生长过程中形成的花粉管通道进入胚囊;授粉45 min和60min进行转化外源DNA进入胚囊的几率较大,因此在此段时间开始转化较为合适;相对于TE缓冲液,将0.05%Silwet L-77和5%蔗糖作为转化溶液可以缩短DNA进入胚囊的时间,但不能提高外源DNA进入胚囊的几率。研究表明,使用fitc标记观察外源DNA进入胚囊效率的方法,可简便有效地应用于花粉管通道法转化条件的初步优化。

关键词：小麦 fitc标记花粉管通道外源DNA

血管紧张素Ⅰ型受体反义寡核苷酸对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统的阻断作用

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中华肾脏病杂志 2005年第4期21卷 199-203页

作者：刘英莉马骥孙晶陆福明刘少军林善锬顾勇复旦大学附属华山医院肾脏科上海200040

目的研究血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)反义(AS)寡核苷酸(ODN)对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)的阻断作用。方法采用单侧肾动脉注射+原位电穿孔的方法, 将AT1 AS-ODN导入到Wistar大鼠的一侧肾脏,观察以fitc荧光标记的ODN在肾脏的... 详细信息

目的研究血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)反义(AS)寡核苷酸(ODN)对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)的阻断作用。方法采用单侧肾动脉注射+原位电穿孔的方法, 将AT1 AS-ODN导入到Wistar大鼠的一侧肾脏,观察以fitc荧光标记的ODN在肾脏的转移位置,以AT1放射自显影定量分析的方法观察转移基因的时间-效应曲线。在基因转移3d后以 RT-PCR、Western印迹及免疫组织化学方法检测肾脏AT1的mRNA和蛋白表达与分布,并与正义(Sen)ODN转移、假注射+肾脏原位电穿孔(Sham)作为对照。结果fitc标记的ODN在基因转移10 min后主要定位于转移侧肾脏的肾小球,而对侧肾脏fitc荧光阴性。AT1放射自显影定量分析显示在基因转移后的3 d内,结合有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的AT1较未转移的对侧肾脏减少约70％。AT1 AS-ODN基因转移后3 d,转移侧肾脏AT1 mRNA水平较对侧肾脏下降约 43％,蛋白水平下降约67％,而与AT1 Sen-ODN和Sham组转移侧肾脏比较,AT1的mRNA水平下降分别约47％和51％,蛋白水平下降分别约63％和71％。免疫组化检查发现AT1的阻断以系膜区的表达减少为主。结论本研究所用的单侧肾动脉注射+原位电穿孔的基因转移方法成功地抑制了单侧肾脏的肾小球AT1受体的表达,为研究全身性疾病肾损害中肾脏局部RAS的短

关键词：局部肾素-血管紧张素系统阻断作用 Ⅰ型受体反义寡核苷酸大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) Western印迹免疫组织化学方法 AS-ODN mRNA水平放射自显影 RT-PCR fitc标记免疫组化检查基因转移方法动脉注射定量分析蛋白水平

利用荧光标记的T7噬菌体研究配体/受体的相互作用

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微生物学通报 2008年第8期35卷 1335-1339页

作者：李姣王爱萍张红张改平王选年易明林鲁琨王秋霞冯丽丽郑州大学郑州450001 河南省动物免疫学重点实验室

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2展示到T7噬菌体表面,以fitc标记纯化的重组噬菌体,通过荧光显微镜观察与流式细胞仪检测,研究标记噬菌体与病毒受体细胞——法氏囊B细胞的相互作用。结果展示有IBDVVP2蛋白的噬菌体经fitc标记后... 详细信息

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)衣壳蛋白VP2展示到T7噬菌体表面,以fitc标记纯化的重组噬菌体,通过荧光显微镜观察与流式细胞仪检测,研究标记噬菌体与病毒受体细胞——法氏囊B细胞的相互作用。结果展示有IBDVVP2蛋白的噬菌体经fitc标记后仍然具有与受体细胞结合的特性,荧光显微镜下可见绿色荧光,流式数据显示其平均荧光强度明显高于阴性对照,且IBDV疫苗株TAD可明显阻断其结合。由此得出结论,fitc标记与噬菌体展示技术相结合,可进行配体/受体间相互作用的研究。

关键词：噬菌体展示 fitc标记传染性法氏囊病病毒(IBDV) VP2蛋白

腺苷对肺再灌注损伤时中性粒细胞CD11b/CD18的影响

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天津医药 2005年第5期33卷 287-289页

作者：王锋王佳祥崔识远张建卿程兆云谢周良河南省人民医院心外科 450003

目的:探讨腺苷预处理对肺缺血再灌注(I/R)全身炎性反应损伤的抑制作用。方法:60只大耳白兔无特定病原体动物(SPF)随机分为3组,每组20只。I组未行缺血再灌注处理;II组行左肺缺血再灌注处理;III组行左肺缺血再灌注处理,并于术前10min经颈... 详细信息

目的:探讨腺苷预处理对肺缺血再灌注(I/R)全身炎性反应损伤的抑制作用。方法:60只大耳白兔无特定病原体动物(SPF)随机分为3组,每组20只。I组未行缺血再灌注处理;II组行左肺缺血再灌注处理;III组行左肺缺血再灌注处理,并于术前10min经颈静脉给予腺苷(adenosine)。采用在体肺缺血再灌注损伤模型,分别于缺血45min,再灌注1,2,4h流式细胞仪测定CD11b/CD18-fitc标记的中性粒细胞(PMN)阳性细胞百分率及左肺组织湿干质量比的变化。结果:Ⅱ组再灌注后各时点CD11b/CD18表达及左肺组织湿干质量比显著高于I组和III组(P<0.01或P<0.05),结论:腺苷预处理可抑制PMN表面CD11b/CD18表达的上调,减轻肺血管内皮细胞的损伤。

关键词： CD11b/CD18 中性粒细胞肺再灌注损伤肺缺血再灌注无特定病原体动物肺血管内皮细胞腺苷预处理全身炎性反应 fitc标记流式细胞仪抑制作用大耳白兔经颈静脉损伤模型阳性细胞肺组织百分率表达及 PMN 量比

豚鼠螺旋神经节细胞中钙磷脂结合蛋白Ⅵ表达及意义

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中国耳鼻咽喉头颈外科 2005年第4期12卷 251-253页

作者：吴先光周梁汕头大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科广东汕头515042 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科上海200031

目的钙离子在耳蜗功能中具有重要作用。本实验探讨与钙离子结合蛋白相关annexin家族中重要成员annexinⅥ在螺旋神经节细胞中的表达和意义。方法用原位杂交的方法检测正常和经过倍频窄带噪声刺激6小时的豚鼠基底膜铺片和石蜡包埋中轴切片... 详细信息

目的钙离子在耳蜗功能中具有重要作用。本实验探讨与钙离子结合蛋白相关annexin家族中重要成员annexinⅥ在螺旋神经节细胞中的表达和意义。方法用原位杂交的方法检测正常和经过倍频窄带噪声刺激6小时的豚鼠基底膜铺片和石蜡包埋中轴切片中annexinⅥmRNA表达,所选用的探针为经过fitc标记的寡核苷酸。结果在正常未经处理的和接受噪声刺激的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞中均可见annexinⅥmRNA表达。接受噪声刺激的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞的染色明显较正常豚鼠强烈。结论annexinⅥ参于内耳的生理活动,短期的噪声刺激后annexinⅥ在螺旋神经节细胞中表达增高。

关键词：磷脂结合蛋白豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞 annexin 表达及 mRNA表达 fitc标记声刺激耳蜗功能蛋白相关石蜡包埋原位杂交寡核苷酸生理活动钙离子基底膜接受

产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测

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产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测

作者：王苗利山东农业大学

学位级别：硕士

为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒... 详细信息

为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位,阐明了产气荚膜梭菌毒素的分布状况,揭示了家畜猝死症的致病机理。首先在厌氧条件下培养复活了A型产气荚膜梭菌标准菌株,提取DNA模板,设计特异性的引物,并对其α毒素的全长基因进行PCR扩增、克隆。以常规基因重组技术,将回收的目的基因片段插入原核表达载pET28a,得到重组质粒,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),转化完成后,用IPTG诱导表达,摸索诱导最优条件后,将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳,并经镍柱亲和纯化目的蛋白;PBS透析,Western blot检测了蛋白的特异性。将表达并纯化的α毒素蛋白500μg混以免疫弗氏佐剂免疫家兔四次,定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度,获得多克隆抗体。将产气荚膜梭菌接种产毒培养基,厌氧环境45C、4h培养,取培养液常规硫酸铵法提取外毒素,用灭菌生理盐水稀释,腹腔皮下注射小鼠,取72h内死亡小鼠的器官组织:心、肝、脾、肺、肾、胃,小肠、延脑,投入4%多聚甲醛中固,然后制作组织切片,用自制的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗,HRP(辣根过氧化物酶)和fitc(荧光素)分别标记的羊抗兔IgG,作为二抗。通过免疫组织化学法对患产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位检测。结果表明,PCR扩增出长度为1228 bp的产物,通过Blast比对,确认为α毒素基因;对表达载体pet28a和含有目的基因的重组T载体分别进行双酶切,并将酶切后的线性pet28回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接,成功构建了pet28a-α表达载体。经IPTG诱导、表达产物经SDS-PAGE电泳,获得大小为45KD特异的表达条带,表达量可达42.1%。Western blot结果证明表达的目的蛋白具有高度的特异性。以表达的α毒素蛋白为抗原,四次免疫家兔后,获得得多克隆抗体经ELISA测定,其效价为1 : 512,000。经免疫组织化学法对器官的毒素分布检测指出,在小鼠的延髓、肠、肾、肺、胃的组织细胞胞浆中发现了阳性颗粒,说明α毒素随血液循环系统进入并侵害了动物的延髓、肠、肾、肺、胃等组织。在脾、肝的血管内发现阳性颗粒,但在主质细胞中未发现毒素分布,说明毒素无法侵害脾肝的主质细胞。研究显示,本实验成功的制备了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体,免疫组化结果提示,首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素,延髓是生命中枢、呼吸、心血管中枢,毒素的侵害使其紊乱,加之毒素对消化系统呼吸系统及肾脏的毒害作用,导致动物死亡。

关键词：产气荚膜梭菌 α毒素家畜猝死症及其机理多克隆抗体免疫组化 HRP标记 fitc标记

布鲁菌病免疫耐受机制及细胞内病原菌荧光检测方法研究

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布鲁菌病免疫耐受机制及细胞内病原菌荧光检测方法研究

作者：胡飞环南方医科大学

学位级别：硕士

背景:布鲁菌病(Brucellosis简称布病)是由布鲁杆菌(简称布菌)引起的人畜共患传染病,能够引起患者多器官系统损伤进而严重降低了患者的生活质量,故而准确诊断布病和治疗尤为重要。我国现行的布病检测主要以血清学为主,病原学的菌培养作... 详细信息

背景:布鲁菌病(Brucellosis简称布病)是由布鲁杆菌(简称布菌)引起的人畜共患传染病,能够引起患者多器官系统损伤进而严重降低了患者的生活质量,故而准确诊断布病和治疗尤为重要。我国现行的布病检测主要以血清学为主,病原学的菌培养作为金标准,但这些传统的诊断方式在布病诊断中容易造成延误,甚至误诊。同时,布病治疗效果也只能通过血清学的抗体水平结合临床症状进行评价,更无法获知患者胞内携菌情况。因此,布病的防治和诊断,以及治疗效果的评价,都迫切需要一种更准确,安全,易操作的病原学诊断方法。Foxp3+调节性T细胞(Treg)是一种对于人体免疫稳态必不可少的T细胞亚型,是诱发免疫耐受/抑制的重要成因。有报道称机体感染病原菌后,Tregs的调控作用会导致病原体不能及时被清除而形成慢性感染。布病极易转为慢性感染,而且易复发,难治愈,但迄今未见我国关于布病感染或治疗过程中机体免疫的临床调查报告,更不清楚Treg介导的免疫耐受在此过程中发挥的作用。目的:1.调查布病患者外周血Treg含量的变化,初步研究Treg介导的免疫耐受与布病慢性感染且难治愈的相关性,最终为个体化免疫治疗方案提供临床数据参考。2.建立一种准确,安全,易操作的布菌抗原检测方法,以期为临床的布病诊断、治疗效果评价和预后判断提供新的参考标准,指导布病的临床治疗。施1、研究对象黑龙江农垦总医院布病患者。2、实验材料抗人CD3、CD4和Foxp3流式抗体;实验室保存的布菌外膜蛋白单抗;293A细胞株、THP-1细胞株;异硫氰酸荧光素(fitc)。3、实验方法流式细胞术,ELISA,细胞免疫荧光,fitc标记抗体,THP-1细胞模拟布菌感染。结果:1、急性期布病患者外周血中的Treg细胞含量与感染持续时间密切相关,经治疗可恢复为健康对照组水平,并且不同的治疗方案对于治疗效果并无明显的改善。2、慢性期布病患者外周血中的Treg细胞含量治疗前后始终维持高位水平。3、筛选了 1个能够与布菌疫苗株反应的单抗5H3,并成功标记荧光素fitc(5H3-fitc),可用于流式细胞技术和免疫荧光技术;抗体活性鉴定结果,上述两种方法均对293FT细胞真核表达的布菌抗原检测灵敏度高。4、利用5H3-fitc检测含菌的THP-1细胞,实验结果显示上述两种方法均能检出细胞内的布菌。结论:1临床调查发现,布病患者外周血中Foxp3+Treg含量有升高趋势,并在慢性期维持高位,推测可能发生了 Treg介导的机体免疫耐受,导致布病难治愈,易复发。2建立了一种利用荧光标记布菌外膜蛋白单抗检测布菌病原体的方法。

关键词：布鲁菌病调节性T细胞 Foxp3 单克隆抗体 fitc标记流式细胞术免疫荧光

共聚焦激光扫描显微镜辅助离子交换介质内蛋白质分布观测

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