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O-GlcNAc修饰对泛素化相关基因的调控

O-GlcNAc修饰对泛素化相关基因的调控

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作者：周丰天津大学

学位级别：硕士

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和O-GlcNAc修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连... 详细信息

多种翻译后修饰之间存在着复杂的联系，这种联系对于细胞活动特别是蛋白的降解和功能的调节起着重要作用。泛素化和O-GlcNAc修饰作为两种重要的翻译后修饰，二者之间存在联系。其中泛素化是泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）催化的多步反应，这些酶中有一些能被O-GlcNAc修饰，或在转录水平受O-GlcNAc修饰的蛋白调节。本研究发现了在HEK293T细胞中的蛋白泛素化和O-GlcNAc修饰的联系。通过在HEK293T细胞中转染OGT，使其过表达sOGT、ncOGT，以及加入PUGNAc（OGA的抑制剂）和加入GLcN三种方式来提高细胞中蛋白的O-GlcNAc的修饰水平。在三种提高O-GlcNAc修饰水平的条件下，通过RT2profiler PCR array方法，检测人泛素化途径相关的84个基因转录水平的变化。其中FBXW10蛋白是一种泛素化的靶特定蛋白F-Box蛋白，在以上增加O-GlcNAc修饰的方式中都出现下调表达。根据GlcN对FBXW10基因有负调节作用，在HEK293T细胞中加入GlcN，在不同时间点进行real-timePCR和Western Blot检测，本研究发现在不同时间点mRNA水平和蛋白水平都有明显下调。另外本研究还发现HEK293T细胞中内源的FBXW10被O-GlcNAc修饰，O-GlcNAc修饰可能在多重水平上调节FBXW10。这些发现都说明O-GlcNAc修饰与泛素化相关基因的调节有关，对理解O-GlcNAc和泛素化之间的相互联系起到重要作用。

关键词：蛋白间相互应答泛素化 O-GlcNAc修饰 F-box蛋白 FBXW10 fbxo4 Real-timePCR 阵列分析

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TNFα通过抑制cyclin D1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱导大鼠BTB成熟延迟

TNFα通过抑制cyclin D1的泛素化降解促进未成熟支持细胞增殖并诱...

引用

作者：吴卫星中国医科大学

学位级别：硕士

目的:在哺乳动物睾丸中,支持细胞(Sertoli cell,SC)对生殖细胞的发育至关重要,SC的最终数目决定精子的产生能力。SC增殖仅发生在胎儿和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子调节,在此期间的未成熟SC可能成为影响睾丸发育的致病性因... 详细信息

目的:在哺乳动物睾丸中,支持细胞(Sertoli cell,SC)对生殖细胞的发育至关重要,SC的最终数目决定精子的产生能力。SC增殖仅发生在胎儿和青春期前期,主要由卵泡刺激素和旁分泌因子调节,在此期间的未成熟SC可能成为影响睾丸发育的致病性因素的重要靶点。TNFα(tumor necrosis factorα)在睾丸中具有多种生物学活性,参与生精细胞发育的多个过程。SC是TNFα发挥病理或生理性作用的主要靶点。TNFα通过识别SC上的受体参与成熟BTB(blood-testis barrier)周期性重建、细胞凋亡和炎症反应。研究发现,TNFα可诱导体外培养的未成熟SC增殖,但缺乏其调节途径和作用机制研究及体内实验验证。本研究试图揭示TNFα影响未成熟SC增殖的作用机制及其对BTB成熟过程的影响。方法:***α对未成熟SC增殖的影响及泛素化PCR Array筛选差异基因。体外分离培养10 d龄SD鼠原代SC培养1-7 d,于第2 d给予不同浓度TNFα处理,于不同时间点分别采用(1)CCK-8、EdU检测细胞增殖率;(2)泛素化PCR Array筛选差异基因,qPCR验证TNFα(10 ng/ml)对fbxo4表达影响;(3)免疫印迹检测PCNA、fbxo4、cyclin D1表达水平;(4)免疫共沉淀检测fbxo4与cyclin D1的相互作用及cyclin D1泛素化水平。***4过表达对TNFα促SC增殖效应的影响。构建含大鼠fbxo4基因全长的腺病毒重组质粒,包装病毒颗粒后选取适宜MOI值于培养第2 d感染原代未成熟SC 24 h,于第4 d进行TNFα处理,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。3.抑制NFκB活性对TNFα促SC增殖效应的影响。免疫印迹检测相关信号通路蛋白活性。体外培养10 d SD大鼠SC,筛选抑制NFκB通路的最佳PDTC浓度,于第2 d采用PDTC(10μM)预处理SC 2 h后加入TNFα联合处理48h,检测细胞增殖率和相关蛋白表达量的改变。4.体内研究检测TNFα对未成熟大鼠BTB功能建立的影响。体内实验选取12 d未成熟的雄性SD大鼠作为研究对象。连续3 d每天腹腔注射TNFα(10μg/kg b w),对照组注射等体积的dd HO,于不同时间点(16 d、20 d、24 d、26 d、30 d、32 d、35 d)进行如下实验:(1)生物素标记法检测大鼠体内BTB通透性,比较各组BTB功能成熟的时间点;(2)免疫荧光检测BTB连接蛋白分布;(3)免疫印迹检测PCNA、fbxo4、cyclin D1和连接蛋白水平。结果:***α抑制cyclin D1泛素化并促进未成熟SC的增殖:CCK-8、EdU实验和PCNA表达水平变化显示TNFα处理明显促进未成熟SC增殖;泛素化PCR Array筛选出5个相关差异基因(>3倍);免疫印迹显示TNFα显著下调E3泛素连接酶fbxo4,而其底物cyclin D1水平升高;免疫共沉淀显示TNFα抑制了cyclin D1与fbxo4的相互作用及其泛素化。***4过表达抑制TNFα对未成熟SC的促增殖作用:腺病毒Ade-fbxo4体外感染原代未成熟SC,免疫印迹检测fbxo4成功过表达;CCK-8和EdU试验表明,与Adv-fbxo4组相比,Adv-fbxo4+TNFα组细胞增殖无显著变化;免疫印迹及免疫沉淀结果显示,与Adv-fbxo4组相比,Adv-fbxo4+TNFα组PCNA、cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平均无显著变化。***α通过活化NFκB促进未成熟SC的增殖:免疫印迹发现TNFα处理后p-p38/p38、p-IκBα/IκBα及p-NFκB p65/NFκB p65比值增加,说明TNFα可活化未成熟SC的p38 MAPK及NFκB通路;CCK-8及EdU试验均显示NFκB抑制剂PDTC处理后,TNFα不能促进未成熟的SC增殖(p38 MAPK抑制剂则无此效应);免疫印迹及免疫沉淀结果亦表明PDTC处理后,TNFα不再引起PCNA、fbxo4和cyclin D1的表达水平及cyclin D1泛素化水平的明显改变。此外,fbxo4过表达后TNFα仍能活化NFκB。***α处理未成熟大鼠引起BTB成熟滞后:体内BTB功能检测发现TNFα处理组BTB于35 dpp左右功能成熟明显晚于对照组(24 dpp)。免疫荧光显示TNFα处理后连接蛋白occludin、JAM-A在BTB的分布明显低于相同天龄的对照组。但随着大鼠天龄的增大,TNFα预处理引起的occludin、JAM-A的表达分布差异越来越小,并分别在26 dpp(JAM-A)和32 dpp(occludin)后恢复正常。结论:TNFα通过

关键词： TNFα 未成熟Sertoli细胞血睾屏障 NFκB fbxo4 cyclin D1 泛素化

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