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LC/ESI-mS分析糖蛋白中的n-糖链

LC/ESI-MS分析糖蛋白中的N-糖链

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作者：徐萌延边大学

学位级别：硕士

糖基化作用是典型的蛋白质翻译后修饰,是一种与生物体的生命活动及生理生化密切相关的一种化学生物反应,是在酶的控制下在蛋白质或脂质上附加糖类从而形成糖蛋白的过程。糖蛋白影响着多种多样的生物活性,例如,细胞间的识别与黏附、蛋白... 详细信息

糖基化作用是典型的蛋白质翻译后修饰,是一种与生物体的生命活动及生理生化密切相关的一种化学生物反应,是在酶的控制下在蛋白质或脂质上附加糖类从而形成糖蛋白的过程。糖蛋白影响着多种多样的生物活性,例如,细胞间的识别与黏附、蛋白质的折叠及结构稳定性、免疫响应等。研究表明,许多生物疾病的发生与发展如恶性肿瘤、癌症、胃肠道消化道等疾病均与糖蛋白糖链的表达量及结构位点的变化有关。因此,对于糖蛋白糖链的定性及定量研究具有积极的现实意义。本文基于endo-m-n175q酶的转糖基反应特性,利用LC/ESI-mS和受体,建立糖蛋白n-糖链的分析方法。首先,基于endo-m-n175q转糖基反应酶的转糖基特性,它能够在酶反应的条件下,将糖蛋白n-糖链在两个GlcnAc间切断,把得到的整个寡糖链轻松的与带有Asn-GlcnAc片段的糖基受体连接。因此,通过这种策略,在前人的研究基础上,合成了以Boc-Asn-GlcnAc为母体的PDPZ-Boc-Asn-GlcnAc标记受体,将其应用于糖蛋白中n-连接寡糖链的检测。其次,研究在糖蛋白的变性,寡糖的酶切过程中化学试剂(nP-40)对寡糖检测的影响。使用排除实验的方法,对杂质的来源进行分析,优化糖蛋白处理的过程,建立一种新的简便高效的糖蛋白变性,寡糖的酶切方法。与此同时,为了优化简化糖蛋白处理的过程,本实验室研究创立了一种新的糖蛋白处理方法,避免了加入额外的化学试剂,减少了反应时间和反应过程,避免了反应液转移过程中的损失。最后,利用优化后的糖蛋白n-糖链分析方法,基于endo-m-n175q酶和受体对高甘露糖型糖蛋白牛胰核糖核酸酶-B进行了分析,成功检测到了 m5-9n2五种寡糖;继而对杂合型糖蛋白卵清蛋白及复杂型糖蛋白胎球蛋白进行了分析,分别检测到了 m5-7n2,m4-5n3,m3n4-,m4m4 九种寡糖及 n2m5,S1-2G2n4m3,S1-4G3n5m3七种寡糖,得到了较为满意的结果,说明此方法具有广泛的应用性与实用性,将为糖蛋白糖链的研究提供分析技术支撑。

关键词：糖基化糖基受体 endo-m-n175q 糖蛋白处理方法

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利用HPLC/ESI-mS建立糖蛋白中n-糖链的分析方法

利用HPLC/ESI-MS建立糖蛋白中N-糖链的分析方法

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作者：徐长帅延边大学

学位级别：硕士

蛋白质糖基化是人体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,人体中超过50%的蛋白质是糖基化的。研究发现,寡糖在蛋白质结构构造、生物活性中起着至关重要的作用,人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上n-糖链的结构和表达量的改变有关。因此... 详细信息

蛋白质糖基化是人体中最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,人体中超过50%的蛋白质是糖基化的。研究发现,寡糖在蛋白质结构构造、生物活性中起着至关重要的作用,人类许多疾病的发生和发展都与蛋白上n-糖链的结构和表达量的改变有关。因此,发展和建立分析n-糖链的方法,对生物和病理学研究具有积极现实意义。目前的研究方法主要是化学衍生法,其缺点是需要引入额外的化学试剂、操作步骤繁琐以及有副反应发生。化学酶标记法由于没有化学衍生法的特点,为研究糖蛋白中的n-糖链,提供了新的思路。首先,在本实验室前人工作的基础上,以Boc-Asn-GlcnAc为基础结构单元物质合成了同位素标记糖基受体d0/d8-PDPZ-Boc-Asn-GlcnAc,优化了受体合成方法：以DmT-mm作为反应缩合剂,探索温度、时间、反应物比例对受体产率的影响,合成受体反应产率达到95-98%。随后,我们以标准糖肽SGP为反应底物,对比endo-m酶、(?)endo-m-n175q酶的转糖基活性和水解活性,结果表明endo-m-n175q酶的转糖基活性几乎是endo-m酶的2倍,且endo-m-n175q酶几乎丧失对转糖基产物的水解能力。紧接着我们以标准糖蛋白牛胰核糖核酸酶B为研究对象,对比丙酮富集n-糖链和n-糖苷酶F释放n-糖链两种方法检测糖链的效率,结果表明n-糖苷酶F释放n-糖链简便、高效。为了检验该方法的实用性,我们以卵清蛋白为实际样品,成功、高效地检测出一系列n-糖链(m5n2、m6n2、m7n2、m4n3、m5n3、m3n4、 m3n5、m4n4、m3n6),和文献己报到的寡糖数量一致,正离子模式下这些寡糖都是以二价或三价的形式出现。相比于传统的化学衍生化法,endo-m-n175q酶可以一步完成酶解和转移两个过程,避免了繁琐的步骤以及副反应的发生。因此,我们提出的以含有Boc-Asn-G1cnAc结构单元的化学物质作为糖基受体、结合endo-m-n-175q酶的特性、以HPLC/ESI-mS为检测手段,这一全新的分析方法,对分析糖蛋白中的n-糖链切实高效可行。

关键词：受体 SGP endo-m-n175q 牛胰核糖核酸酶B 卵清蛋白

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基于糖链转移酶的n-糖链相对定量分析研究

基于糖链转移酶的N-糖链相对定量分析研究

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作者：高欢姿延边大学

学位级别：硕士

糖基化是一种在许多生命活动中都占据重要地位的化学反应过程,例如细胞的黏附、宿主-病原体的相互作用、蛋白质合成的控制以及许多细胞因子在生物体内生物活性的保留。研究证明,人类的许多病症如癌症、代谢性疾病、神经退行性疾病等,都... 详细信息

糖基化是一种在许多生命活动中都占据重要地位的化学反应过程,例如细胞的黏附、宿主-病原体的相互作用、蛋白质合成的控制以及许多细胞因子在生物体内生物活性的保留。研究证明,人类的许多病症如癌症、代谢性疾病、神经退行性疾病等,都与蛋白质表面糖链的结构与表达量息息相关。因此,对人体内糖链表达量的监控对于疾病的控制以及发生发展情况的掌握都具有重大意义。利用endo-m酶的转糖基特性,结合基于质谱检测的稳定同位素标记方法,能够在不对标记效果和样品纯化造成不良影响的前提下,完成对n-糖链的相对定量过程。本文第一章对糖链的种类以及生物功能做了简要的介绍,并简单总结了糖链的提取分离和分析方法。第二章是受体的合成。我们在本实验室己发表文献所描述的合成方法的基础上,改进了受体do/d8-PEPZ-Boc-Asn-GlcnAc最后一步的合成方法,利用DmT-mm配合甲醇体系代替TPP-DPDS作为反应催化剂,使反应产率由原先的40%左右提高到80%以上。同时将do/d8-mPEPZ-Boc-Asn-GlcnAc合成过程中的反应溶剂由纯甲醇替换为乙腈-DmF,使得反应能够一次进行完全。并对所得产物进行了核磁、红外、紫外、质谱、液相等表征。第三章通过LC-ESI-mS进行分析,比较了本实验室所合成的四种轻标记受体PEPZ-Boc-Asn-GlcnAc、PDPZ-Boc-Asn-GlcnAc、mPEPZ-Boc-Asn-GlcnAc、 mPDPZ-Boc-Asn-GlcnAc在endo-m-n175q作用下与SGP的反应性后,确定了受体PEPZ-Boc-Asn-GlcnAc为最佳受体,并利用该受体进行了酶反应条件的选择,确定了最佳酶用量为5 mU,以及最佳反应时间为3个小时。在此基础上通过线性关系、动态范围和重现性的考察,建立了基于稳定同位素标记的相对定量方法。

关键词：稳定同位素标记 LC-ESI-mS endo-m-n175q n-糖链相对定量

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基于突变酶endo-m-n175的糖链相对定量

基于突变酶Endo-M-N175的糖链相对定量

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中国化学会第十三届全国分析化学年会

作者：闵俊哲石清延边大学药学院

基于LC-mS检测的化学标记是进行糖链定量分析的主要手段。这些方法可以在一定程度上能提高糖链分析的选择性和灵敏度,但在衍生化过程中会产生额外的副反应,不仅影响标记效果和样品的纯化,而且难以保持糖链原有结构。鉴于此,本研究以n-... 详细信息

基于LC-mS检测的化学标记是进行糖链定量分析的主要手段。这些方法可以在一定程度上能提高糖链分析的选择性和灵敏度,但在衍生化过程中会产生额外的副反应,不仅影响标记效果和样品的纯化,而且难以保持糖链原有结构。鉴于此,本研究以n-糖链为分析对象,借助糖苷合成酶（endo-m-n175q）转糖基反应[1],建立了既能一步完成糖链的酶切和标记,又能保持糖链原有结构的靶标n-糖链相对定量分析方法。利用新合成的d0（d8）-受体,利用SGP为模型糖肽考察了同位素标记糖链产物面积比相对定量方法的线性关系、动态范围、重现性和准确性,验证了相对定量方法的有效性。并应用于实际糖蛋白样品Ribonuclease B,Ovalbumin,Fetuin中进行了相对定量分析,结果验证到5种、21种、7种糖链的相对定量。另外,又在人血浆中识别到了15种糖链[2]。本方法简便、既能一步完成糖链的酶切和标记,又能保持糖链原有的结构。为开发糖组学相对定量分析方法提供了新的思路和理论依据,为差异性糖组学的发展提供了新的分析方法。

关键词：糖链相对定量 endo-m-n175q 稳定同位素 LC-mS/mS

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