检索结果-南通市图书馆

作者：李文进北京化工大学

学位级别：硕士

在化学结构上，辅酶Q以醌环为核心，连上一个聚异戊烯侧链。其生理功能主要来自醌基的氧化还原化学特性和侧链的物理特性。作为线粒体呼吸链中重要的递氢体，它是细胞自身的天然抗氧化剂，在氧化磷酸化中起着重要的作用。它是人体中唯... 详细信息

在化学结构上，辅酶Q以醌环为核心，连上一个聚异戊烯侧链。其生理功能主要来自醌基的氧化还原化学特性和侧链的物理特性。作为线粒体呼吸链中重要的递氢体，它是细胞自身的天然抗氧化剂，在氧化磷酸化中起着重要的作用。它是人体中唯一的辅酶Q类物质，其异常的代谢与人体的许多疾病相关联。目前，辅酶Q已作为一种重要的生化药物和多功能保健品被广泛研究。本文以粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)为研究对象，从抑制和沉默角鲨烯代谢支路的角度，对辅酶Q的合成代谢进行了研究，并对辅酶Q发酵生产工艺进行了优化。首先，把合成的56bp siRNA寡核苷酸序列插入到mU6 pro载体中，成功构建了mU6-ERG9-shRNA10、mU6-ERG9-shRNA32、mU6-ERG9-shRNA585三株针对不同靶位点的特异性突变株。将zeo基因准确插入到ERG9基因序列中，pGEM-ERG9-zeo基因敲除表达框载体构建成功。同时对shRNA表达载体构建过程进行了优化，控制退火缓冲液PH在7.5，提高NaCl含量至150mmol／L以上，退火产物予以10mol／L CHNO除盐及100％CHO沉淀处理，退火效率可达到90％以上。通过紫外诱变菌种选育，得到了06-2-8、06-3-15、06-5-27、06-6-11四株具有稳定性的高产菌株。确定UV诱变剂量90s时突变效果最佳。与出发菌株相比，辅酶Q产量正变率达到8.33％。实验确定了C／N最佳优化比为1.6，当前体物质对羟基苯甲酸添加浓度为1.2mg／L时，CoQ产量达到3.44mg／L，比不添加提高了14％。 zeocin耐受性实验确定了转化株在培养基中筛选浓度为150μg／mL。与原始菌株相比，S．pombe ERG9突变株生产CoQ的能力下降了5.62％，菌株生长周期延长近10h，但重组菌有较高的遗传稳定性和菌体生物量，72代后，重组菌S．pombe ERG9生长周期减少了近6h，与原始菌CoQ产量相对差值缩小6.61％。初步实现了基因沉默工程菌在发酵生产CoQ中的探索，S．pombe mu6-siRNA突变株变异和退化现象较严重，发酵水平较原始菌株下降了10.7％，为进一步研究基因沉默技术在生产CoQ中的应用奠定了基础。辅酶Q的提取采用溶剂萃取法，改进了溶剂萃取法的提取工艺：将细胞先用盐酸于热水浴中进行预处理，然后在用丙酮于室温下进行提取，并进一步优化了提取条件。优化后的提取条件为：将细胞用盐酸于80℃水浴进行预处理，处理时间为80min，然后用丙酮对处理后的细胞于室温下进行抽提，提取时间为2.5h。

关键词：角鲨烯合成酶 RNA干扰 ERG9 辅酶Q10 发酵优化

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角鲨烯合成酶特异性mU6-siRNA真核表达载体的构建及鉴定

引用

生物技术通报 2007年第3期23卷 115-117,121页

作者：李文进袁其朋李晔程冰北京化工大学生命科学与技术学院北京100029

利用RNA干扰技术靶向构建角鲨烯合成酶基因ERG9特异性真核表达载体。将针对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ERG9不同部位所设计的3对siRNA序列通过重组技术克隆到质粒mU6 pro中构建真核表达重组体mU6 ERG9 siRNA1、2、3... 详细信息

利用RNA干扰技术靶向构建角鲨烯合成酶基因ERG9特异性真核表达载体。将针对粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe Linder)ERG9不同部位所设计的3对siRNA序列通过重组技术克隆到质粒mU6 pro中构建真核表达重组体mU6 ERG9 siRNA1、2、3,转化DH5α菌株扩增,提取质粒通过限制性酶切和测序分析对重组表达载体进行鉴定,分析结果表明3个表达载体的设计基因插入正确,成功构建了ERG9特异性真核表达载体mU6 ERG9 siRNA,重组体的成功构建为在裂殖酵母细胞中靶向RNA干扰角鲨烯的合成从而提高辅酶Q10合成途径的代谢通量打下基础。

关键词：角鲨烯合成酶 RNA干扰 ERG9 辅酶Q10

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