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增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达

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西北农业学报 2012年第2期21卷 103-106页

作者：刘华伟张宏孙超王庆贺宋艳瑞西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100

以EGFP为标记基因,原核表达质粒pGEX-4T-1为载体,成功构建重组质粒pGEX-4T-EGFP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)。用IPTG进行诱导表达,通过紫外照射和SDS-PAGE检测其在大肠杆菌中的表达情况,为原核表达系统提供新的报告基因和筛选标记。

关键词： EGFP 克隆重组质粒原核表达

东方拟无枝酸菌HCCB10007内attB位点的人工构建

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中国抗生素杂志 2014年第3期39卷 193-197页

作者：盖忆青朱丽陈代杰张怡轩沈阳药科大学生命科学与生物制药学院沈阳110016 上海交通大学上海200240

目的在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率。方法在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码... 详细信息

目的在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率。方法在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码序列插入到东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组中,然后将带有绿色荧光蛋白基因(EGFP)的特异性位点重组质粒pLYGYQ2导入该工程菌中。用于验证整合系统的有效性。结果获得基因组中整合有attB位点的基因工程菌LYGYQA。EGFP基因顺利整合入所构建的attB位点,并且获得了表达。同时发现该系统的整合效率较同源重组效率提高了约3倍。结论本研究不但表明来源于链霉菌的位点特异性整合系统可以成功应用于东方拟无枝酸菌中,也证明绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因用于该菌的研究。

关键词：东方拟无枝酸菌 attB EGFP

用于猪干细胞示踪的Oct4-EGFP报告系统建立

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用于猪干细胞示踪的Oct4-eGFP报告系统建立

作者：刘畅中国农业科学院

学位级别：硕士

多能性干细胞既可以自我更新又可以分化成许多其他细胞类型，为发育生物学、细胞治疗及基因修饰的研究提供了基础，然而，猪的胚胎干细胞（ES）还未能建立，诱导多能性干细胞（iPS）研究中仍存在许多问题亟待解决。利用细胞多能性标记... 详细信息

多能性干细胞既可以自我更新又可以分化成许多其他细胞类型，为发育生物学、细胞治疗及基因修饰的研究提供了基础，然而，猪的胚胎干细胞（ES）还未能建立，诱导多能性干细胞（iPS）研究中仍存在许多问题亟待解决。利用细胞多能性标记基因建立报告系统，可以为上述研究提供有价值的工具。Oct4基因是一种重要的细胞多能性标记，被广泛应用于小鼠及其它物种的多能性细胞的鉴定，可以用于干细胞示踪报告系统的建立。Oct4-EGFP是一种有效的细胞多能性可视化报告系统，转基因猪可作为细胞多能性研究的一种有重大价值的大动物模型，有助于猪ES和iPS细胞的建立。本研究利用TALENs（Transcription activator-like effector nuclease）介导的同源重组，将EGFP（enhanced green fluorescent protein）定点敲入内源性Oct4第5外显子的终止密码子处，利用内源性Oct4启动子驱动EGFP cDNA，从而更精确的示踪内源性Oct4的表达情况。成功建立了五指山小型猪Oct4-EGFP细胞系，通过体细胞核移植获得了Oct4-EGFP克隆胚胎。结果如下：研究一：定制了TALENs并进行了工作效率检测。TALENs是一种新型的基因编辑工具，能够识别并结合目的基因并对其产生切割作用从而诱导基因突变或提高同源重组的效率。研究以建立的五指山小型猪耳成纤维细胞系为材料，测定了该细胞系Oct4基因终止密码子附近序列，根据该序列定制了两对针对Oct4基因终止密码子的TAELNs，其DNA结合和切割的位点略有不同。转染TALENs质粒五指山小型猪耳成纤维细胞48h后，对TALENs靶位点序列进行PCR扩增，PCR产物克隆至T载体，转化感受态细胞后均匀挑取40个菌落测序，突变序列与有效测序总数的比值即为TALENs的工作效率，2对TALENs工作效率分别为15%和13.2%。研究二：构建了基因敲入供体载体（Donor DNA）。以Oct-4终止密码子上游1.2kb序列为左同源臂（LA），通过重组PCR将2A-EGFP基因与左同源臂融合;以Oct-4终止密码子下游657bp序列为右同源臂（RA）。载体采用正负筛选策略，在左同源臂和右同源臂之间加入用于正筛选的两端带有LoxP位点的neo抗性基因，右同源臂下游加入用于负筛选的TK基因（载体的结构为：LA-2A-EGFP-LoxP-neo-LoxP-RA-TK）。TALENs mRNA与打靶载体共转染五指山小型猪耳成纤维细胞系，TALENs介导的同源重组将EGFP cDNA及两端带有LoxP位点的neo抗性基因插入五指山小型猪Oct-4基因的终止密码子处。经过G418和GANC（丙氧鸟苷）筛选获得抗性克隆点514个，经跨左同源臂，跨右同源臂及跨EGFP-neo3轮PCR鉴定共获得杂合阳性克隆点36个，打靶效率为7%（36/514）。研究三：阳性克隆点neo抗性基因的删除和转基因克隆胚胎的制备。细胞瞬时转染环状Cre重组酶载体质粒以删除neo抗性标记，经PCR鉴定有条带大小的变化，据此判断转染Cre重组酶载体质粒的细胞中有一部分切除了neo抗性标记基因。转染了Cre重组酶质粒的细胞未经筛选，直接作为核供体，以去核后的体外成熟猪卵母细胞为胞质供体，利用体细胞核移植技术获得克隆胚胎。生产的克隆胚胎经鉴定，有部分胚胎删除了neo抗性标记。在8细胞期和囊胚期观察克隆胚胎EGFP的表达情况，以普通体细胞克隆胚胎为阴性对照，未见有明显的绿色荧光。上述结果表明，TALENs介导的同源重组适合用于大动物的基因修饰，与传统的同源重组相比，可以很大程度地提高打靶效率。正负筛选策略可以有效地富集阳性细胞。将Cre-LoxP系统应用于基因打靶载体的构建，可以在获得阳性细胞后将筛选标记删除，从而避免抗性标记对内源性基因结构造成破坏或对其表达情况产生影响。总之，本研究成功地将EGFP定点敲入内源性Oct4第5外显子的终止密码子处，建立了利用TALENs介导的基因定点敲入的技术平台，为后续猪基因修饰的研究提供了一定的依据。

关键词：猪干细胞示踪 Oct4 EGFP TALEN 基因敲入

山羊骨骼肌表达载体plMAU-EGFP的构建

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山羊骨骼肌表达载体plMAU-EGFP的构建

作者：杨波内蒙古农业大学

学位级别：硕士

目前尚缺乏研究山羊肉品质基因的适宜模型，有关山羊肉分子机理的研究还相对落后。鉴于转基因技术存在一系列潜在危险且改变基因组难度较大，本论文借鉴人类基因治疗的理念和原理构建了适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体。我们... 详细信息

目前尚缺乏研究山羊肉品质基因的适宜模型，有关山羊肉分子机理的研究还相对落后。鉴于转基因技术存在一系列潜在危险且改变基因组难度较大，本论文借鉴人类基因治疗的理念和原理构建了适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体。我们利用骨骼肌α-肌动蛋白的调控原件，肌肉钙粘蛋白M-cadherin的信号肽以及EGFP基因共同构建了可以直接在动物体肌肉细胞内异位表达并分泌EGFP的表达质粒pGEM-A5A3f-M-EGFP(pIMAU-EGFP)。该载体的构建为研究山羊肉肉品质基因奠定了重要的基础。本研究得出的结论如下： 1、成功获得本研究中的转录起始单元：骨骼肌α-肌动蛋白启动子5’-侧翼区核苷酸序列，大小为2440bp以及大小为816bp的携带Ploy(A)尾的骨骼肌α-肌动蛋白启动子3-’侧翼区核苷酸序列。通过测序验证，表明构建的表达载体中这部分元件是正确可靠的，可以行使转录驱动功能。 2、根据Genbank登录号为：NM07662的参考序列，人工合成含有63bp的M-cadherin基因序列，限制性酶切位点，以及与EGFP基因有20bp重叠区的大引物M-m-cadherin，利用重叠延伸PCR技术成功获得了本载体的核心基因M-EGFP。 3、本研究成功构建了大小为6967bp，以M-EGFP为核心基因的骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP，经测序验证其序列的正确性。M-cadherin基因和EGFP基因之间设计的双酶切位点用于后续与肉品质相关的候选基因的插入，为山羊肉质特征功能研究奠定基础。

关键词：骨骼肌 M-钙粘蛋白 EGFP 组织特异性表达载体

丙肝病毒NS5B-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及稳定转染HepG_2细胞系的建立

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 49-51页

作者：雷迎峰薛小平尹文吕欣杨敬第四军医大学微生物学教研室西安710032

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化... 详细信息

目的　构建可表达丙型肝炎病毒 (HCV)NS5B EGFP融合蛋白的真核表达载体 ;获得重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。方法　利用PCR技术从HCV基因组中扩增出ns5b基因片段 ,XhoⅠ KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP N3真核表达载体 ,转化TG1菌株感受态细胞 ,获得阳性重组质粒pEGFPN3 ns5b。将阳性克隆用脂质体法转染HepG2 细胞 ,经持续G4 18压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系。结果　成功构建了真核表达载体pEGFPN3 ns5b ;建立了其重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系。结论　重组质粒稳定转染的HepG2 细胞系可表达NS5B EGFP融合蛋白 ;该HepG2

关键词： HepG2细胞稳定转染真核表达载体 EGFP 重组质粒融合蛋白丙肝病毒阳性克隆 b基因感受态细胞

Amaxa Nucleofector^(TM)核转染仪转染白血病细胞株L1210

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中国实验血液学杂志 2010年第6期18卷 1604-1608页

作者：杨阿碰马洁娴秦文明谢彦晖金由辛复旦大学华山医院血液科上海200040 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞研究所上海200031

慢性淋巴细胞白血病细胞株L1210是广泛运用于白血病发病机制以及化疗药物研究的细胞模型,但该细胞株与其它悬浮细胞株一样,存在着转染效率低的难题。本研究旨在探讨如何提高L1210细胞株的转染效率。应用报告基因pEGFP并通过Amaxa Nucleo... 详细信息

慢性淋巴细胞白血病细胞株L1210是广泛运用于白血病发病机制以及化疗药物研究的细胞模型,但该细胞株与其它悬浮细胞株一样,存在着转染效率低的难题。本研究旨在探讨如何提高L1210细胞株的转染效率。应用报告基因pEGFP并通过Amaxa NucleofectorTM核转染仪的几种转染预设模式转染悬浮L1210细胞,与脂质体Lipofectamine 2000转染进行对比,在荧光倒置显微镜下观察、使用流式细胞术检测转染效率,用台盼蓝排斥实验比较存活率。结果表明:使用核转染仪进行转染在L1210细胞中获得了很高的转染效率,且在一样细胞密度(2×106/ml)和质粒量(10μg)条件下,在24小时后进行比较,核转染仪预设模式A-20转染效率达(61.6%),明显高于其它模式(S-18、T-20),存活率可达50.5%;脂质体转染24小时细胞存活率为88%,但转染效率极低(<1%)。结论:核转染仪转染L1210的效率明显高于脂质体转染方案,其转染效率最高可达61.6%,存活率可达50.5%,此结果可满足科研工作需求。

关键词： L1210 EGFP 核转染脂质体转染

Analysis of the Cellular Localization of Herpes Simplex Virus 1 Immediate-early Protein ICP22

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Virologica Sinica 2010年第3期25卷 158-167页

作者： Wei CUN Jie CHEN Ying ZHANG Long-ding LIU Qi-han LI Institute of Medical Biology Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College Kunming 650118 China

Nuclear proteins often form punctiform structures, but the precise mechanism for this process is unknown. As a preliminary study, we investigated the aggregation of an HSV-1 immediate-early protein, infected-cell protein 22 (ICP22), in the nucleus by observing the localization of ICP22-EGFP fusion protein. Results showed that, in high-level expression conditions, ICP22-EGFP gradually concentrates in the nucleus, persists throughout the cell cycle without disaggregation even in the cell division phase, and is finally distributed to daughter cells. We subsequently constructed a mammalian cell expression system, which had tetracycline- dependent transcriptional regulators. Consequently, the location of ICP22-EGFP in the nucleus changed with distinct induction conditions. This suggests that the cellular location of ICP22 is also influenced by promoter regulation, in addition to its own structure. Our findings provide new clues for the investigation of transcriptional regulation of viral genes. In addition, the non-protease reporter system we constructed could be utilized to evaluate the role of internal ribosome entry sites (IRES) on transcriptional regulation.

关键词：即刻早期蛋白单纯疱疹病毒细胞定位 EGFP 哺乳动物细胞转录调控表达系统蛋白聚集

编码基因完整的伪狂犬病毒细菌人工染色体的构建

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黑龙江畜牧兽医 2016年第12期 1-4,9,295页

作者：陈利红王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶A... 详细信息

为了构建包含伪狂犬病毒(PRV)完整编码基因的细菌人工染色体(BAC),首先对PRV基因组进行了分析,确定了单一酶切位点AcclⅠ,用PCR方法扩增出上下游同源臂、EGFP表达盒并同BAC质粒一起克隆到p UC_(18)质粒,获得转移载体;将经限制性内切酶AcclⅠ处理过的病毒全基因组连同转移载体共同转染BHK21细胞,获得重组病毒;利用PCR检测、电镜观察及生长曲线测定对野毒与重组毒的基本特性进行了比较。结果表明:重组病毒可以稳定地表达绿色荧光,BAC在传代过程中能够稳定存在;重组病毒在电镜下的形态与野毒未见差异,其生长曲线也基本同野毒吻合。说明成功构建的编码基因完整的PRV细菌人工染色体可用于该病毒的结构生物学及致病机理研究。

关键词：伪狂犬病毒(PRV) 细菌人工染色体(BAC) 完整结构基因组重组病毒 EGFP

复合型氧化石墨烯纳米载体对肝癌模型的化学—光热联合治疗

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复合型氧化石墨烯纳米载体对肝癌模型的化学—光热联合治疗

作者：张溪之湖南大学

学位级别：硕士

近年来,氧化石墨烯作为一种单片层的二维碳纳米材料,由于其良好生物相容性、易修饰性、体内与体外药物运输与光热效应等独特物理化学性质,已经在生物医学领域取得重大进展并有着进一步发展潜力。本文通过设计与合成一种功能化氧化石墨... 详细信息

近年来,氧化石墨烯作为一种单片层的二维碳纳米材料,由于其良好生物相容性、易修饰性、体内与体外药物运输与光热效应等独特物理化学性质,已经在生物医学领域取得重大进展并有着进一步发展潜力。本文通过设计与合成一种功能化氧化石墨烯纳米材料,对其材料性能与特质进行改性,使其有较大的比表面积、芳香族分子负载能力、π-π共轭作用和氢键相互作用,将其应用于化学-光热协同治疗以及基因传递。研究结果表明,我们合成的功能化氧化石墨烯纳米材料在生物医学领域有着巨大的潜在应用价值。本文的主要研究内容如下:1、构建一种尺寸可控、稳定强性、生物相容性好的化疗-光热还原氧化石墨烯纳米体系本章中,我们采用一种廉价、方便、快速的方法,将按1:1的混合比例的高分子聚乙烯亚胺（25K）与低分子聚乙烯亚胺（1.8K）混合物与氧化石墨烯进行酰胺化反应,再与甲氧基聚乙二醇氨基在90℃下水浴还原反应,生成一种复合聚乙烯亚胺与聚乙二醇修饰的纳米级还原氧化石墨烯。利用原子力显微镜（AFM）、Zeta电位仪、紫外可见分光光度计（UV-vis）、傅里叶红外光谱仪（FT-IR）等对样品进行表征。可知:还原氧化石墨烯尺寸大小为100-300nm,厚度为1.5-2.5nm,电势为+23.4m V。在近红外3W/cm~2功率照射下,还原氧化石墨烯呈现出良好的光热效应和光稳定性,负载阿霉素之后光热性能不改变。荧光分光光度法、药物负载与释放、体外细胞摄取等实验表明,还原氧化石墨烯能够高效负载阿霉素,负载率可达81.56%,并在pH=5.3条件下,其药物释放率在48小时内能够达到50%。纳米级还原氧化石墨烯的构建,为后续生物医学研究提供了一个很好的基础。此外,将还原氧化石墨烯与增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）通过π-π共轭作用结合,作用于肝癌SMMC-7721细胞转染。琼脂糖凝胶电泳表明正电荷聚电解质还原氧化石墨烯在N/P为10时,能与EGFP完全结合,电势依旧呈现为正值。在基因转染中,还原氧化石墨烯与EGFP在N/P为40时,呈现出高达78%的转染效率。本工作表明,还原氧化石墨烯能够作为一种优良的基因载体。2、还原氧化石墨烯纳米体系对人肝癌SMMC-7721细胞的化学与光热联合治疗本章中,在在近红外激光（NIR）照射条件下,我们将负载阿霉素的还原氧化石墨烯作用于肝癌SMMC-7721细胞以及小鼠肿瘤模型,探究其化学与光热的协同治疗。细胞摄取实验表明还原氧化石墨烯能够很好地负载阿霉素进入细胞,并在溶酶体中有效释放,最终进入细胞核。光照射会促进药物释放,同时不会影响还原氧化石墨烯在胞内摄取。细胞毒性实验表明还原氧化石墨烯负载阿霉素能对肝癌细胞呈现出巨大杀伤作用。体内实验证明还原氧化石墨在光热效应与阿霉素化疗作用下,小鼠肿瘤在20天便达到消亡,有着很好治疗效果。

关键词：还原氧化石墨烯阿霉素 EGFP 基因传递化学-光热联合治疗