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浙江近海曼氏无针乌贼资源演变、EGFP放流标志技术与增殖放流效果评估

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浙江近海曼氏无针乌贼资源演变、EGFP放流标志技术与增殖放流效果...

作者：李继姬浙江海洋学院

学位级别：硕士

本论文综合曼氏无针乌贼渔业生物学特性及其资源演变、EGFP放流标志技术初步研究、增殖放流效果评估、渔业资源管理策略初步研究四个方面对浙江海域曼氏无针乌贼资源恢复展开了研究。论文综合国内、外的研究内容，就曼氏无针乌贼的曼... 详细信息

本论文综合曼氏无针乌贼渔业生物学特性及其资源演变、EGFP放流标志技术初步研究、增殖放流效果评估、渔业资源管理策略初步研究四个方面对浙江海域曼氏无针乌贼资源恢复展开了研究。论文综合国内、外的研究内容，就曼氏无针乌贼的曼氏无针乌贼生活史、曼氏无针乌贼的洄游、曼氏无针乌贼的产卵特性、曼氏无针乌贼的近海生长特性等渔业生物学特征以及其浙江省曼氏无针乌贼资源演变过程和演变原因进行综述。得出结论，曼氏无针乌贼资源从50年代末至21世纪初经历的渔业高产、资源衰竭、资源恢复三重变化都和其自身的渔业生物学特征紧密相关，并认为资源演变的各个部分的形成原因均与人类海洋开发活动有关。为了更有效地评估增殖放流效果和现有资源量估算，以及考虑到现有标志技术的缺陷，论文初步研究了对曼氏无针乌贼受精卵进行标记的EGFP标记技术，以保证回捕研究数据的完整性和减少放流成本。EGFP标记技术的精髓在于将结合曼氏无针乌贼-肌动蛋白基因启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组DNA与乌贼基因组整合，并让曼氏无针乌贼受精卵细胞组成型表达EGFP，将EGFP的绿色荧光特性载入乌贼所有体细胞内以达到标志的目的。曼氏无针乌贼增殖放流效果评估方面采用资源密度估算法估算现存资源量，通过2010、2011年舟山六横-中街山海域、台州大陈海域、温州洞头海域定置张网捕捞调查数据估算了浙江海域曼氏无针乌贼现存资源量，并预测未来四年内资源增殖前景。估算2010、2011年各海域的曼氏无针乌贼资源量依次分别为—舟山：1.30×10头、1.71×10头;台州：5.70×10头、7.07×10头;温州：3.62×10头、4.68×10头，折合全省资源量达到2,794.73t、3,795.82t。若未来4年增殖放流量维持2011年的放流标准，预测2015年浙江海域资源量达到2011年的2.77倍—7.99×10头，折合重量达到1.05万吨。论文最后对曼氏无针乌贼资源修复及保护策略展开有针对性的初步研究，在资源恢复初期需要从以下几个方面出发进行渔业资源管理：持续不断地进行曼氏无针乌贼增殖放流工作;与此同时对产卵场的进一步修复和保护以复建曼氏无针乌贼赖以生存的栖息地;在人为影响方面，洄游路径上禁止捕捞作业以缓解人为捕捞压力，并严格控制年捕捞量，在资源恢复初期建议禁止捕捞曼氏无针乌贼，以减轻对增殖放流工程产生的巨大压力。

关键词：曼氏无针乌贼 EGFP 放流标记技术增殖放流资源评估

外源EGFP表达对肿瘤细胞体外生物学行为的影响

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基础医学与临床 2012年第2期32卷 211-216页

作者：张敏赵文晶冯海凉刘艳艳李占稳刘玉琴中国医学科学院基础医学研究所病理学系北京100005

目的探讨常用的可视化细胞标记技术-外源EGFP表达对肿瘤细胞生物学行为的影响。方法选择不同的携带EGFP的载体,利用脂质体转染或慢病毒感染技术,在不同肿瘤细胞系中表达外源EGFP,筛选稳定表达外源EGFP的细胞系,MTT法检测细胞体外增殖能... 详细信息

目的探讨常用的可视化细胞标记技术-外源EGFP表达对肿瘤细胞生物学行为的影响。方法选择不同的携带EGFP的载体,利用脂质体转染或慢病毒感染技术,在不同肿瘤细胞系中表达外源EGFP,筛选稳定表达外源EGFP的细胞系,MTT法检测细胞体外增殖能力;细胞分析计数仪(CasyTT型)检测细胞大小;Transwell体外迁移实验检测细胞体外侵袭能力。结果成功建立了稳定表达外源EGFP的人结肠癌细胞系HCT116-GFP、HCT116-EG-FP、COLO320DM-EGFP和小鼠树突状细胞肉瘤细胞系DG6-EGFP。HCT116-EGFP细胞、COLO320DM-EGFP细胞和DG6-EGFP细胞的体外增殖能力明显降低;HCT116-EGFP细胞体积增大:平均直径分别为(14.53±0.07)μm(HCT116)和(18.28±0.16)μm(HCT116-EGFP)(PEGFP细胞的体外侵袭能力明显降低(PEGFP可视化标记细胞后,可能会影响肿瘤细胞的生物特性,利用这些模型进行科研时,需注意对相关指标的影响。

关键词： EGFP 肿瘤细胞系增殖侵袭

Stable EGFP Gene Expression in C6 Glioma Cell Line after Transduction with HIV-1-based Lentiviral Vector

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Chinese Journal of Cancer Research 2008年第4期20卷 243-248页

作者：金贵善刘福生柴奇王建交历俊华 Beijing Neurosurgical Institute Capital University of Medical Sciences

Objective： To establish a stable C6/EGFP glioma cell transfected with the human immunodeficiency virus line for studies on glioma. Methods： The C6 glioma cell line was type I （HIV-1） based lentivirus vector containing two enhancer-promoters CMV and EF1α. Enhanced green fluorescent protein （EGFP）-positive C6 cells were sorted out by fluorescence-activated cell sort. Expression of EGFP was observed by fluorescent microscopy. EGFP gene in C6 genome was assessed by Polymerase chain reaction （PCR） and DNA sequencing. Original and transfected cells were compared biologically and cytomorphologically. Results： Lentivirus vector transfection produced up to 40% EGFP-positive cells. After fluorescence-activated cell sort selection, a pure cell line C6/EGFP was established. PCR and DNA sequencing revealed integration of EGFP gene in C6 cell genome. Analysis of cell characteristics revealed no difference between transfected and original cells. Conclusion： A C6/EGFP cell line expressing EGFP as a marker is established, in which the EGFP gene is integrated into the genome. This cell line can be served as a promising tool for further basic research and gene therapy studies.

关键词： Lentivirus EGFP C6 cell line Gene therapy

超声击破微泡介导EGFP转染类风湿性关节炎大鼠关节滑膜组织的实验研究

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中华超声影像学杂志 2012年第2期21卷 182-183页

作者：景香香刘洁杨炳昂符少清刘秉彦莫泽来李作田海南省人民医院超声科海口570311 海南省人民医院急诊骨科海口570311

关节疾病的基凶治疗足当今国内外研究的热门课题。超声击破微泡造影剂介导作为一种新型的堪因转染方法．在心脏、腑、角膜及肿瘤组织中得到实验证实。本实验旨在探讨该方法在类风湿性荚竹炎（rheumatoidarthritis，RA）滑膜组织中实现... 详细信息

关节疾病的基凶治疗足当今国内外研究的热门课题。超声击破微泡造影剂介导作为一种新型的堪因转染方法．在心脏、腑、角膜及肿瘤组织中得到实验证实。本实验旨在探讨该方法在类风湿性荚竹炎（rheumatoidarthritis，RA）滑膜组织中实现基冈转染的可能性。

关键词：关节滑膜组织微泡造影剂实验研究类风湿性关节炎大鼠转染 EGFP 介导

α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响

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α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响

作者：吴静雯福建师范大学

学位级别：硕士

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统因其兼具真核生物和原核生物的特点,自投入使用以来,已成功使用该系统表达了超过1000种的外源蛋白。作为外源蛋白表达系统,表达量是其最核心的评价指标之一。在毕赤酵母中,虽然有一些蛋白能得到高... 详细信息

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统因其兼具真核生物和原核生物的特点,自投入使用以来,已成功使用该系统表达了超过1000种的外源蛋白。作为外源蛋白表达系统,表达量是其最核心的评价指标之一。在毕赤酵母中,虽然有一些蛋白能得到高分泌表达,但多数蛋白在毕赤酵母中分泌表达量只能达到mg/L级。因此,如何找到一种普适性的方法,提高毕赤酵母中信号肽引导的外源蛋白分泌表达量,这对于完备毕赤酵母表达系统具有重要的意义。信号肽是分泌蛋白进入分泌通道重要先决条件,对蛋白的分泌表达有重要影响。本研究从信号肽入手,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告蛋白,研究S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种酵母α-factor信号肽及其前导肽对报告蛋白分泌表达的影响。研究发现,S.cerevisiaeα-factor信号肽可以很好的引导EGFP的分泌表达,而K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下;S.cerevisiaeα-factor信号肽引导的外源蛋白胞外表达量是K.pastoris和K.phaffii的98.2倍和13.5倍。从外源蛋白胞内滞留、蛋白降解、基因整合拷贝数、转录水平、密码子偏好性等方面对S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种α-factor信号肽进行分析,发现K.pastoris和K.phaffii的α-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下并非是这些原因造成。对三种α-factor信号肽潜在N-糖基化位点进行分析,发现S.cerevisiaeα-factor信号肽的前导肽上存在三个N-糖基化位点,而在K.pastoris和K.phaffii的α-factor上没有N-糖基化位点。将S.cerevisiaeα-factor前导肽三个N-糖基化位点上的N突变成Q,使之不能被N-糖基化,其表达量下降了近50.3%。同时,在K.pastoris和K.phaffiiα-factor前导肽上引入一个N-糖基化位点后,表达量有显著提高,分别提高了31.5倍和5.2倍。这些结果说明α-factor前导肽的N-糖基化修饰有助于外源蛋白的分泌表达,K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽不能很好引导外源蛋白的分泌是由于缺少N-糖基化而引起的。进一步以S.cerevisiaeα-factor信号肽为模型,研究前导肽上N-糖基化的数量和位置对分泌表达的影响,结果表明,前导肽上N-糖基化的数量和位置对表达量没有明显影响。本研究为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了技术手段,也为进一步的机制研究奠定很好的前期基础,同时,也为外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达所需的信号肽提供了更多的选择。

关键词：毕赤酵母 α-factor 信号肽外源蛋白表达 EGFP N-糖基化

真核表达载体pEGFP-GPC3的构建及表达

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第5期28卷 462-465页

作者：刘春辉张志明刘剑勇广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科广西南宁530021

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达。方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5... 详细信息

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)真核表达载体pEGFP-GPC3,并在小鼠树突状细胞(DC)表达。方法:将质粒pCMV-SPORT6-GPC3和载体pEGFP-N1分别进行双酶切获得目的基因GPC3片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli DH5α菌株,用EcoR I、BamH I双酶切鉴定后通过脂质体法转染到DC中,然后进行荧光检测和Western blot分析。结果:构建的真核表达载体pEGFP-GPC3,转染DC后,荧光显微镜下可见转染的DC中有EGFP-GPC3融合蛋白的表达,Western blot分析发现有相对分子质量(Mr)大小约为67 000的蛋白条带。结论:成功地构建了真核表达载体pEGFP-GPC3并在转染DC后能在其中表达,为进一步研究GPC3基因的功能提供实验基础。

关键词： GPC3 EGFP 真核表达树突状细胞

J亚群禽白血病病毒env基因主要功能区和EGFP基因在SSff9细胞中的融合表达

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中国家禽 2015年第11期37卷 23-26页

作者：李拓凡多婷梁雄燕顾玉芳杨玉莹长江大学动物科学学院湖北荆州434025

为获得具备良好抗原性和生物活性的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)env基因主要功能区的表达产物,采用特异性引物分别从保存的p MD18T-envHB2010质粒、PIRES2-EGFP中扩增ALV-J env基因主要功能区和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,酶切、连接后... 详细信息

为获得具备良好抗原性和生物活性的J亚群禽白血病病毒(ALV-J)env基因主要功能区的表达产物,采用特异性引物分别从保存的p MD18T-envHB2010质粒、PIRES2-EGFP中扩增ALV-J env基因主要功能区和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,酶切、连接后插入p Fast Bac Daul载体,构建杆状病毒转移载体p Fast Bac Daul-env-EGFP,将其转化DH10Bac感受态细胞制备重组杆粒Bacmid-env-EGFP,转染Sf9细胞进行真核表达。结果显示,转染了重组杆粒的Sf9细胞在倒置荧光显微镜下呈现亮绿荧光;以ALV-J单克隆抗体JE9进行Western blot检测,转染重组杆粒的Sf9细胞检测出约85 ku的条带。结果表明,目的基因在Sf9细胞中得到了良好的表达,为进一步研究ALV-J提供基础试验材料。

关键词： ALV-J env基因 EGFP 融合表达

心脏特异表达绿色荧光斑马鱼模型的建立与评估

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遗传 2013年第4期35卷 511-518页

作者：彭夕洋陈婷芳黄婷江志钢吴秀山邓云湖南师范大学心脏发育研究中心发育生物学与蛋白质组学教育部重点实验室长沙410081

本课题组前期研究中,利用斑马鱼cmlc2(Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系,并初... 详细信息

本课题组前期研究中,利用斑马鱼cmlc2(Cardiac myosin light chain 2)基因启动子构建了一个用于斑马鱼心脏组织特异表达外源基因的转基因表达载体pTol2-cmlc2-IRES-EGFP。文章利用该载体构建了一个稳定表达EGFP的转基因斑马鱼品系,并初步分析了EGFP的表达对该转基因斑马鱼品系的心脏发育和功能的影响。结果表明,在建立的转基因斑马鱼品系早期胚胎发育过程中,绿色荧光信号在心脏中特异表达,该表达模式与原位杂交分析的cmlc2的表达模式结果相同;该转基因斑马鱼品系的心脏形态及发育生长正常;进一步通过M-Mode分析心脏生理学功能的结果表明:该转基因品系心动周期、心率、收缩与舒张表面积及表面积缩短率等重要生理指标与正常野生型的斑马鱼对照组相比没有显著差别。以上结果表明该转基因品系中绿色荧光蛋白的表达对斑马鱼心脏的发育和功能没有影响。研究结果为进一步利用该载体建立外源目的基因转基因表达模型,研究心脏表达基因的功能奠定了重要基础。

关键词：斑马鱼转基因 EGFP Tol2转座子

p53-EGFP表达载体的构建及其对A549的影响

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山地农业生物学报 2019年第1期38卷 1-5页

作者：胡昌亮尹志刚俸婷婷周英贵州大学生命科学学院贵州贵阳550025 贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心贵州贵阳550025 贵州省药食两用资源应用开发工程实验室贵州贵阳550025 贵阳中医学院药学院贵州贵阳550002

构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体,并验证其对肺癌细胞A549的影响。以质粒pcDNA3.1-p53为模板,设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53,将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上,用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,双酶切以及测序... 详细信息

构建具有EGFP标签的抑癌基因p53表达载体,并验证其对肺癌细胞A549的影响。以质粒pcDNA3.1-p53为模板,设计引物并进行PCR扩增获得目的基因p53,将获得的目的基因克隆至载体pcDNA3.1-EGFP上,用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,双酶切以及测序验证。将克隆好的载体,利用脂质体法转染A549细胞,荧光显微镜下观察,同时用MTT法测不同时间段细胞OD值。结果表明,琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因扩增成功。双酶切及DNA测序结果均证实,成功构建了载体pcDNA3.1-EGFP-p53。转染A549细胞后,荧光显微镜下观察到绿色荧光。MTT法测定结果表明,目的基因转染的A549细胞组所测得的OD值明显低于对照组(pEGFP标签的抑癌基因p53表达载体pcDNA3.1-EGFP-p53构建成功,转染A549细胞后,对A549细胞具有一定抑制作用。为后续继续研究p53-MDM2生物发光能量共振转移作用奠定了基础。

关键词： EGFP 抑癌基因 p53 表达载体 A549细胞