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高压均质对EGCG-OSA玉米淀粉复合体的结构及其抗氧化特性的影响

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食品工业科技 2021年第23期42卷 20-26页

作者：黎明明李璐解新安李雁华南农业大学食品学院广东广州510642

为探究高压均质作用对EGCG-OSA玉米淀粉复合体的影响,分别采用加热、高压均质以及先高压均质后加热的方法制备了EGCG-OSA玉米淀粉复合体,利用傅里叶红外(FT-IR)、X射线衍射(XRD)与电镜扫描(SEM)对其结构、形貌进行表征;利用高级流变仪... 详细信息

为探究高压均质作用对EGCG-OSA玉米淀粉复合体的影响,分别采用加热、高压均质以及先高压均质后加热的方法制备了EGCG-OSA玉米淀粉复合体,利用傅里叶红外(FT-IR)、X射线衍射(XRD)与电镜扫描(SEM)对其结构、形貌进行表征;利用高级流变仪以及粒度仪对其流变性进行研究;通过测定复合物的DPPH和ABTS自由基清除率比较其抗氧化活性。结果表明:三种复合体均有很高的抗氧化性,并且三种复合体的抗氧化性随储藏时间下降的幅度较小,其中用先均质后加热方式制备的复合体具有最高的抗氧化性,在30 d后DPPH清除率仍能达到89.63%,ABTS自由基清除率达到98.66%;FT-IR与XRD结果表明复合物并没有产生新的化学键和官能团;流变性测试结果则表明:经过高压均质作用后的复合体,黏度下降幅度更大,粒径也有所减小。综上表明,通过先高压均质后加热方式制备的复合体具有更高的抗氧化性和更为优良的储藏稳定性,研究结果能为EGCG在淀粉类食品的加工及生产中的应用提供理论及实验基础。

关键词：高压均质 OSA玉米淀粉 EGCG 抗氧化性理化性质

L-茶氨酸与EGCG联合干预对卵清蛋白致敏小鼠肠道特异性免疫的调节作用及机制

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L-茶氨酸与EGCG联合干预对卵清蛋白致敏小鼠肠道特异性免疫的调节...

作者：宋宪颖湖南农业大学

学位级别：硕士

特异性免疫是机体对外界抗原产生的保护机制,卵清蛋白等食物抗原导致食物过敏后肠道特异性免疫失调与机体健康密切相关。L-茶氨酸和EGCG是绿茶中两种主要活性成分,均具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种生物活性,但鲜见两者联合调节机体... 详细信息

特异性免疫是机体对外界抗原产生的保护机制,卵清蛋白等食物抗原导致食物过敏后肠道特异性免疫失调与机体健康密切相关。L-茶氨酸和EGCG是绿茶中两种主要活性成分,均具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种生物活性,但鲜见两者联合调节机体免疫尤其是特异性免疫功能的相关研究。本研究通过建立卵清蛋白致敏模型小鼠,分别用L-茶氨酸(100mg·kg·d)、EGCG(100mg·kg·d)、L-茶氨酸+EGCG低、中、高剂量(50mg·kg·d;100mg·kg·d;150mg·kg·d;其中L-茶氨酸与EGCG质量比为1:4)干预6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠41天。采用酶联免疫、流式细胞术、16S r DNA、Western blot等方法,从模型小鼠体重、过敏反应、肠道形态结构、血清特异性抗体与过敏介质、肠道细胞因子、肠道PP结淋巴细胞增殖、肠道菌群及肠道相关蛋白表达等方面,研究分析了L-茶氨酸与EGCG联合干预对卵清蛋白致敏小鼠肠道特异性免疫的调节作用及机制。主要研究结果及结论如下:(1)卵清蛋白致敏小鼠模型的建立。采用雌性BALB/c小鼠、OVA致敏剂量为50μg及激发次数为4次的方法,小鼠过敏评分和OVA-IgE指标值均能达到致敏标准要求,可成功建立卵清蛋白致敏小鼠模型。(2)对肠道特异性免疫的调节作用。与OVA组相比,L-茶氨酸、EGCG及L-茶氨酸+EGCG联合干预均能显著抑制血清IgE、OVA特异性抗体的产生,显著减少过敏介质HIS和m MCP-1的释放(PEGCG联合干预能显著抑制OVA激发引起的免疫器官指数上升(PEGCG及L-茶氨酸+EGCG联合干预还能够抑制肠道中Th17细胞、DC细胞(MHC-ⅡCD11c)和MC细胞(FcεRⅠαc-KIT)的分化,降低Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13含量,促进Th1细胞分泌IFN-γ以及Treg细胞分泌IL-10、TGF-β1(PEGCG及L-茶氨酸+EGCG联合还能抑制OVA致敏引起的肠道微生物多样性的下降,增加乳杆菌科和乳酸杆菌属的丰度,降低有害菌螺杆菌科与螺杆菌属的丰度(PEGCG联合干预调节肠道特异性免疫的效果优于EGCG或L-茶氨酸单独干预组。(3)对肠道特异性免疫调节作用的机制。与OVA组相比,L-茶氨酸、EGCG以及L-茶氨酸+EGCG联合干预均能显著下调与过敏相关的FcεRⅠ信号通路上游关键蛋白Lyn、Syk磷酸化表达,阻止Lyn和Syk启动PI3K/AKT信号途径,显著下调PI3K和AKT信号分子的磷酸化表达(P<0.05),抑制FcεRⅠ信号通路的激活,抑制肥大细胞MC的活化,增强免疫细胞Treg的功能,抑制Th2型免疫的发生,维护Th1/Th2平衡和肠道稳态,调节肠道特异性免疫功能,从而抑制过敏反应的发生。

关键词： L-茶氨酸 EGCG L-茶氨酸+EGCG 卵清蛋白致敏模型 FcεRⅠ信号途径

基于合成致死策略开展EGCG的抗肿瘤作用研究

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基于合成致死策略开展EGCG的抗肿瘤作用研究

作者：杨志珍天津科技大学

学位级别：硕士

在中国,绿茶的种植历史可以追溯到古代,属于当之无愧的“茶之大国”,人们早就发现绿茶对于人类健康具有颇多益处。天然产物EGCG作为绿茶中的主要有效成分,对人类体内细胞的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌和抗感染等方面扮演着重要角色。研... 详细信息

在中国,绿茶的种植历史可以追溯到古代,属于当之无愧的“茶之大国”,人们早就发现绿茶对于人类健康具有颇多益处。天然产物EGCG作为绿茶中的主要有效成分,对人类体内细胞的抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌和抗感染等方面扮演着重要角色。研究表明,EGCG可以作为人皮瓣核酸内切酶1(hFEN1)的抑制剂特异性地对肿瘤细胞的DNA复制和修复造成影响,而不影响正常细胞的生命活动。本论文以hFEN1和其抑制剂EGCG为研究靶点,致力于其合成致死搭档的探索,并应用合成致死策略对其抗肿瘤活性进行评价。首先,根据癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)数据库发现hFEN1在泛癌组织中的表达量与正常组织细胞相比有显著的增加,其表达量的高低也与多种类型癌症的预后效果密切相关。本课题在查阅相关文献后,发现MRE11在胃癌中具有高突变,可能与FEN1存在合成致死关系。通过构建MRE11基因缺陷的胃癌细胞系,经过MTT和构建小鼠移植瘤模型等实验等确定了EGCG对MRE11缺陷的胃癌细胞系存在明显的治疗效果。然后,在受到CRISPR/Cas9筛选系统的启发后,本课题构建了人类全基因组敲除文库细胞(#67989 Library),加以EGCG筛选,待细胞生长趋于稳定后提取细胞基因组,通过高通量测序对sg RNA的富集差异进行分析。我们认为,MAPK11基因可能与EGCG的抑制作用有关。最后,本课题利用抑制剂SB203580抑制了MAPK11激酶的表达,结果发现MAPK11被抑制的肿瘤细胞对EGCG更加敏感,使肿瘤细胞更快发生死亡,并且这种促进效果经验证后发现是由EGCG抑制了hFEN1引发合成致死性实现的。总之,EGCG可以通过靶向抑制hFEN1,与相关基因发生合成致死效应实现抗肿瘤作用,不仅拓展了新型靶向抗肿瘤治疗的手段,也开发出一条多酚类天然产物能够辅助治疗癌症的抗癌道路,为其提供科学依据。

关键词：人皮瓣核酸内切酶1(hFEN1) 绿茶多酚 EGCG CRISPR/Cas9 胃癌治疗合成致死

EGCG对改善双酚A诱导小鼠肝脏代谢与肠道微生物群落紊乱的影响

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EGCG对改善双酚A诱导小鼠肝脏代谢与肠道微生物群落紊乱的影响

作者：金方莎安徽农业大学

学位级别：硕士

双酚A(bisphenol A,BPA)作为一种环境内分泌干扰物广泛存在于水体、土壤等环境中。研究表明长期暴露BPA可能对机体多个系统器官产生不良影响,包括生殖毒性、发育毒性、神经毒性、内分泌干扰效应等。其中,BPA诱导脂质代谢紊乱尤其受到关... 详细信息

双酚A(bisphenol A,BPA)作为一种环境内分泌干扰物广泛存在于水体、土壤等环境中。研究表明长期暴露BPA可能对机体多个系统器官产生不良影响,包括生殖毒性、发育毒性、神经毒性、内分泌干扰效应等。其中,BPA诱导脂质代谢紊乱尤其受到关注。表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocate chin-3-gallate,EGCG]是绿茶中含量较高的重要生物活性成分之一,研究表明该成分在改善脂质代谢紊乱等方面具有良好的效果,包括抑制脂肪细胞的分化和增殖、减轻肥胖动物体重、减少脂肪含量以及抑制脂肪生成等。为了探究EGCG对环境内分泌干扰物BPA诱导小鼠脂质代谢紊乱的影响,本研究建立了BPA诱导下的脂质代谢紊乱小鼠模型,通过EGCG干预,测定小鼠体内与脂质代谢相关的生理生化指标的变化,明确EGCG对改善BPA诱导小鼠脂质代谢紊乱的功效,同时利用微生物组学和代谢组学,探究EGCG干预下BPA对于小鼠肠道微生物及代谢表型的影响,揭示其分子机制。主要研究结果如下:(1)基于先前的报道,构建了BPA暴露下脂质代谢紊乱的小鼠模型。暴露于BPA(0.5μg/kg/d,为人类日常接触剂量)的小鼠体重、肝脏重量及肝脏重量与体重比分别为37.2g、2.15g、4.28,与对照组相比均增加。同时小鼠肝脏和血清种甘油三酯、胆固醇水平升高,肝脏呈现脂质堆积情况。(2)基于上述模型,测定了EGCG干预下小鼠生理生化指标的变化。暴露12周后,低剂量EGCG处理组的体重、肝脏重量分别为33.8g、1.79 g,高剂量EGCG处理组小鼠体重、肝脏重量分别为32.7 g、1.88 g,与BPA处理组相比,小鼠体重、肝脏重量以及甘油三酯、胆固醇水平下降,脂质代谢均有所改善,同时低剂量的EGCG改善效果优于高剂量。(3)EGCG干预下小鼠脂质合成与代谢相关基因的表达情况。实验结果表明,BPA诱导小鼠脂肪酸生物合成相关基因Elovl6和胆固醇生物合成相关基因Lss表达显著增高,而EGCG干预下Elovl6、Lss基因的表达显著降低。此外,EGCG促进小鼠脂肪酸氧化相关基因CYP4A14和胆固醇代谢相关基因CYP7a1基因的表达,实现对BPA诱导脂质代谢紊乱的调控。(4)EGCG对小鼠肠道微生物的影响。实验结果表明,与对照组相比,在门水平上,BPA处理组小鼠中厚壁菌门(97.25%)显著增加,放线菌门(1.88%)则显著降低;在属水平上,对照组中乳酸杆菌属(81.33%)和棒状杆菌属(8.60%)的丰度较高,BPA处理组乳酸杆菌属的丰度增加至95.09%,同时棒状杆菌属的丰度显著下降至0.33%。EGCG干预后,小鼠的肠道优势菌门和菌属的组成趋向于对照组。(5)EGCG对小鼠血清代谢物的影响。对照组与BPA处理组代谢表型,筛选鉴定出121种差异代谢物,牛磺酸(taurine)、瓜氨酸(citrulline)、胆甾烯酮(cholestenone)、甘油磷酸胆碱(glycerophosphocholine)、糖去氧胆酸7硫酸盐(glycochenodeoxycholic acid 7-sulfate)、4-(2-氨基苯基)-2,4-二氧丁酸(4-(2-aminophenyl)-2,4-dioxobutanoic acid)、甘氨酰胆酸(glycocholic acid)、胆固醇葡萄糖醛酸(cholesterol glucuronide)等92种差异代谢物显著上调;丙二酸(malonic acid)、N-乙酰-L-谷氨酸-5-半乳糖醛(n-acetyl-l-glutamate 5-semialdehyde)、促甲状腺素释放激素(thyrotropin releasing hormone)、1-哌啶-2-羧酸(1-piperideine-2-carboxylic acid)等29种差异代谢物显著下调。EGCG干预后可使差异代谢物回调,主要通过调控改善初级胆汁酸生物合成、色氨酸代谢来改善BPA诱导的小鼠脂质代谢紊乱。综上所述,EGCG可通过影响小鼠脂肪酸、胆固醇生物合成与代谢以及肠道微生物群落结构与组成,改善BPA诱导的小鼠脂质代谢紊乱。研究结果为BPA的风险评价及EGCG的高效利用提供数据支撑和理论依据。

关键词： BPA EGCG 脂质代谢肠道菌群代谢组学

硫化铁-EGCG纳米药物的制备及其缓解急性肾损伤的应用研究

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硫化铁-EGCG纳米药物的制备及其缓解急性肾损伤的应用研究

作者：朱雨菲扬州大学

学位级别：硕士

急性肾损伤(AKI)通常表现为数小时至数天内血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)突然升高、尿量减少和肾小球滤过率(GFR)下降,AKI通常伴有多种并发症,如高钾血症、代谢性酸中毒、容量超负荷和GFR降低导致的尿毒症症状。AKI是一种复杂疾病,手术、... 详细信息

急性肾损伤(AKI)通常表现为数小时至数天内血清肌酐(CRE)和尿素氮(BUN)突然升高、尿量减少和肾小球滤过率(GFR)下降,AKI通常伴有多种并发症,如高钾血症、代谢性酸中毒、容量超负荷和GFR降低导致的尿毒症症状。AKI是一种复杂疾病,手术、脓毒症、创伤和对药物的毒性反应都可能诱发AKI。在AKI的发生发展过程中,活性氧(ROS)在肾功能的稳态中起着至关重要的作用。当ROS生成和消除之间的平衡被打破时,肾脏浸润和内源性细胞产生的过量ROS会通过线粒体肿胀和功能障碍诱导细胞凋亡。不幸的是,目前只有温和的治疗方法,如补液、肾透析和其他一些支持性治疗。因此,开发有效的治疗AKI的药物迫在眉睫。鉴于ROS在AKI的发生和发展中的重要作用,消除ROS似乎是预防和治疗AKI的一种有希望的策略。随着纳米技术的出现并迅速发展,具有抗炎抗氧化治疗效果的纳米药物成为包括AKI在内的各种ROS相关疾病的有效治疗药物,预计将对人类健康产生深远影响。其中,纳米酶因其既有天然酶的高催化活性,又有模拟酶稳定而经济的特点,在众多药物中脱颖而出。纳米酶克服了天然酶只能在温和条件下才能发挥催化作用的局限性,并且具有模拟过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等天然酶活性,对ROS表现出广谱的清除能力。硫化氢(H2S)是一种无处不在的气态信号分子,是三种内源性气体递质之一,在许多生理过程中起着重要作用,如神经调控、血管张力调节、细胞保护、氧感应、炎症调节和细胞生长。多硫化氢(H2Sn)已被发现可以由3-巯基丙酮酸硫转移酶(3MST)产生,并能够调节离子通道、肿瘤抑制因子和蛋白激酶的活性。蛋白质的半胱氨酸残基过硫化被认为是H2S作用的一种方式,H2S将硫原子添加到目标蛋白的半胱氨酸残基上,从而发挥作用。由于H2S与半胱氨酸残基中硫的氧化态相同,H2S不易对半胱氨酸残基硫化。相反,氧化态为0或-1的H2Sn很容易硫化半胱氨酸残基的硫醇。肿瘤抑制蛋白磷酸和紧张素同源物(PTEN)、蛋白激酶G1α和糖酵解酶甘油-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等蛋白都是H2Sn的靶蛋白。中药是以中国传统医药理论指导采集、炮制、制剂,说明作用机理,指导临床应用的药物。中药主要来源于天然药及其加工品,包括植物药、动物药、矿物药及部分化学、生物制品类药物。除了纳米药物具有清除ROS抗氧化的能力以外,中药多酚也可以与ROS相互作用,从而在细胞活力受到严重影响之前终止链式反应。中药多酚是存在于植物中的天然化合物,具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)是绿茶的主要多酚成分,是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂,可用于治疗多种疾病。EGCG已被证明具有抗炎、抗关节炎、抗菌、抗血管生成、抗衰老、抗病毒和神经保护作用,这些作用可能在治疗许多疾病中具有治疗应用,包括动脉粥样硬化和心血管和代谢疾病。EGCG可以通过清除自由基来达到抗氧化的目的,与铁螯合是清除自由基的一种重要方式。此外,EGCG在体内外都能增加与氧化应激相关的抗氧化酶的水平,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和血红素加氧酶-1(HO-1)等。在多种不同的儿茶素成分中,EGCG是诱导HO-1表达的最有效的诱导剂。硫化铁纳米酶具有较好的自由基清除活性,也含有丰富的亚铁离子,基于此,我们将EGCG与硫化铁纳米酶结合,利用EGCG与铁的螯合作用,发挥更强的清除自由基和细胞保护能力,对AKI也有较好的治疗效果。本论文共分为两个部分,就单独GFeSNs清除ROS治疗AKI和EGCG-GFeSNs清除ROS治疗AKI两个方面展开研究,以下为主要内容:1.GFeSNs作为活性氧清除剂缓解急性肾损伤在AKI进展过程中,过量产生ROS与细胞和组织发生反应,导致不可逆和永久的细胞和组织损伤。因此,清除ROS是治疗AKI的关键。在本章,我们采用溶剂热合成法制备得到了四种硫化铁纳米酶(CFeSNs、DFeSNs、GFeSNs和TFeSNs),通过扫描电子显微镜、多硫化氢释放和超氧自由基(O2·-)的清除效率等实验筛选出了具有小尺寸片层结构的硫化铁纳米酶GFeSNs,实验结果表明,与CFeSNs、DFeSNs和TFeSNs相比,GFeSNs具有最高的多硫化氢释放能力和O2·-清除能力,因此我们选用GFeSNs进行后续实验。高倍透射电镜和元素映射图谱显示,GFeSNs为大小约为200nm的均匀片层结构,主要由Fe和S两种元素组成,与EDS图谱的元素分析一致。X射线衍射图谱和X射线光电子能谱图显示GFeSNs主要由FeS组成。接着,我们进一步详细检测了 GFeSNs的多硫化氢释放能力和各种自由基清除能力,结果表明,GFeSNs对·OH、O2·-、ABTS·+、H2O2和DPPH等自由基有很强的清除能力。细胞实验表明,GFeSNs在浓度为2.5至20 μg/mL的范围内

关键词：纳米酶硫化铁 EGCG 急性肾损伤活性氧

Cardiac troponin I R193H mutant interacts with HDAC1 to repress phosphodiesterase 4D expression in cardiomyocytes

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Genes & Diseases 2021年第4期8卷 569-579页

作者： Weian Zhao Qian lu Jing Luo Bo Pan Ling-Juan Liu Jie Tian Department of Anesthesiology The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen UniversityGuangzhouGuangdong Province510080PR China Department of Cardiology Children’s Hospital of Chongqing Medical UniversityMinistry of Education Key Laboratory of Child Development and DisordersChongqing Key Laboratory of PediatricsChina International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical DisordersChongqing401122PR China

Cardiac Troponin I(cTnI)is a subunit of the thin filament involved in regulation of heart contraction.Mutated cTnI accounts for most genetic mutations associated with restric-tive cardiomyopathy(RCM).We previously found phosphodiesterase 4D(PDE4D)decreased in RCM mice with cTnIR193H mutation and the mutant cTnI might be involved in PDE4D reduction.This study aims to elucidate a novel role of cTnIR193H mutant as a gene regulator.Overexpres-sion of cTnIR193H mutant in cardiomyocytes showed decrease in PDED4D protein expression,while the enrichment of histone deacetylase 1(HDAC1)was increased along with decreases in acetylated lysine 4(acH3K4)and 9(acH3K9)levels in the PDE4D promoter.HDAC1 overex-pression could also downregulate PDE4D via reducing acH3K4 and acH3K9 levels.Co-IP assays showed that cTnIR193H mutant owed increased binding ability to HDAC1 compared with wild type cTnI.EGCG as a HDAC1 inhibitor could diminish the strength of cTnIR193H-HDAC1 inter-actions and alleviate the reduction in PDE4D expression.Together,our data indicated that cTnIR193H mutant could repress PDE4D expression in cardiomyocytes through HDAC1 associ-ated histone deacetylation modification.Unlike the typical function of cTnI in cytoplasm,our study suggested a novel role of cTnI mutants in nuclei in regulating gene expression.

关键词： cTnIR93H EGCG HDAC1 Histone modifications PDE4D reduction

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基于高光谱成像的茶叶中EGCG分布可视化

农业工程学报 2018年第7期34卷 180-186页

作者：李晓丽魏玉震徐劼赵章风钟江何勇浙江大学生物系统工程与食品科学学院杭州310058 嘉兴学院生物与化学工程学院嘉兴314001 浙江工业大学机械工程学院杭州310014

针对目前关于表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)在茶叶中的分布缺乏可视化表达问题,该文采用高光谱成像技术以实现EGCG在茶叶中的分布可视化。通过高光谱成像仪采集茶叶的光谱信息,按照标准方法 HPLC(high perfo... 详细信息

针对目前关于表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)在茶叶中的分布缺乏可视化表达问题,该文采用高光谱成像技术以实现EGCG在茶叶中的分布可视化。通过高光谱成像仪采集茶叶的光谱信息,按照标准方法 HPLC(high performance liquid chromatography)法测量茶叶的EGCG浓度。运用化学计量学方法建立光谱与EGCG浓度之间的回归模型。为寻求相对较优的模型效果,对光谱进行不同的预处理,以确定最优的预处理方法;采用4种建模方法建立回归模型,以确定最优的建模方法;对光谱进行特征波段选择,以降低数据冗余提高模型的稳定性和运算速度。最后,将高光谱图像中像素点对应的光谱变量导入模型,从而生成EGCG浓度分布图。结果表明:可见-近红外光谱与EGCG浓度之间具有很强的相关性,其回归模型的决定系数达到0.905,利用高光谱成像技术对茶叶中EGCG分布进行可视化可行。通过对不同品种、叶位的茶叶中EGCG浓度分布进行可视化,能够为高EGCG浓度茶树品种的培育、EGCG代谢规律的分析以及茶树采摘部位的识别提供有效手段。

关键词：作物光谱分析图像处理模型茶叶高光谱成像 EGCG 分布可视化

EGCG对热应激巴马香猪肠道屏障功能的影响及作用机制

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EGCG对热应激巴马香猪肠道屏障功能的影响及作用机制

作者：韦崇万广西大学

学位级别：硕士

环境高温导致猪产生热应激反应,严重降低猪的生长性能和机体健康,制约生猪产业的发展。肠道作为机体免疫防御的第一道屏障,成为近年来生猪热应激研究的热点。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是一种从绿茶中分... 详细信息

环境高温导致猪产生热应激反应,严重降低猪的生长性能和机体健康,制约生猪产业的发展。肠道作为机体免疫防御的第一道屏障,成为近年来生猪热应激研究的热点。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是一种从绿茶中分离得到的多酚类化合物,具有抗炎、提高免疫力的作用。本研究以巴马香猪作为研究对象,构建巴马香猪热应激模型,研究EGCG对热应激巴马香猪肠道屏障功能的影响及作用机制,为今后开发EGCG作为一种能缓解猪热应激,并能通过调控肠道屏障功能进而改善猪肠道健康的绿色饲料添加剂提供科学依据。主要研究内容与结果如下:1、EGCG对热应激巴马香猪生长性能和生理生化指标的影响选取25头平均体重为34 kg的8月龄雄性巴马香猪,随机分成5个处理,每组5头猪:其中第1组为常温对照组(TN组,22℃,自由采食),第2组为常温采食量配对组(PF组,22℃,采食量配对),另外3组为35℃高温组,分别在日粮中添加0%EGCG(HS0组,自由采食)、0.025%EGCG(HS250组,自由采食)和0.05%EGCG(HS500组,自由采食)。正式试验为28 d。试验结束后采血并屠宰,测定生长性能、血液生理生化等指标。结果表明:(1)热应激显著增加了巴马香猪血清中HSP70的浓度,EGCG显著降低热应激巴马香猪血清中HSP70的浓度。(2)热应激显著增加巴马香猪直肠温度和呼吸频率,显著降低其末重、平均日增重及平均日采食量,增加料重比,EGCG可以显著降低热应激巴马香猪的直肠温度和呼吸频率,改善其生长性能。(3)热应激显著增加血清中GLB、ALT、UREA及炎症因子IL-6、IL-8的浓度,显著降低GLU的浓度。EGCG显著降低热应激巴马香猪血清中GLB、ALT、UREA及炎症因子IL-6、IL-8的浓度,显著增加GLU的浓度。(4)热应激显著增加血液中白细胞总数、粒细胞、粒细胞比率,显著降低红细胞总数和血红蛋白浓度。EGCG显著降低热应激巴马香猪血液中白细胞总数、粒细胞和粒细胞比率,显著增加红细胞总数和血红蛋白浓度。综上,热应激巴马香猪模型建立成功,为后续利用此模型开展研究奠定了工作基础。2、EGCG对热应激巴马香猪小肠肠道形态及屏障功能的影响取各组猪的十二指肠、空肠和回肠组织进行肠道形态及屏障功能研究,结果表明:(1)热应激引起巴马香猪小肠形态结构的损伤,显著降低小肠绒毛高度及绒隐比,而添加0.05%EGCG有助于肠道形态损伤的恢复,并增加绒毛高度及绒隐比。(2)热应激显著增加巴马香猪小肠中热休克蛋白HSP70和HSP90的表达,表明高温导致巴马香猪小肠产生了热应激反应;热应激增加了小肠中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-8的表达,增加TLR-4的表达,降低肠道紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-3、Occludin以及Muc-2基因的表达。添加EGCG显著降低小肠中热休克蛋白的表达,提高了肠道紧密连接蛋白的表达,降低了TLR-4的表达,从而缓解热应激引起的小肠黏膜损伤和炎症反应,改善了肠道屏障功能,且0.05%EGCG作用效果优于0.025%EGCG。3、EGCG对热应激巴马香猪结肠微生物区系、短链脂肪酸以及TLR-4/NF-κB信号通路的影响取各组猪的结肠内容物及结肠组织,进行结肠微生物区系、短链脂肪酸以及TLR-4/NF-κB信号通路方面的研究,结果表明:(1)热应激显著改变了巴马香猪结肠微生物多样性和结构,显著降低了乳杆菌属、经黏液真杆菌属、霍尔德曼氏菌、Shuttleworthia的丰度,显著增加狭义梭菌属等机会致病菌的丰度,这可能是诱发肠道炎症反应的的重要原因。EGCG可以显著增加热应激巴马香猪结肠乳杆菌属、经黏液真杆菌属、霍尔德曼氏菌等有益菌的丰度,显著减少unclassified＿c＿＿Clostridia、norank＿f＿＿norank＿o＿＿Clostridia＿vadin BB60＿group、norank＿f＿＿norank＿o＿＿Izemoplasmatales等机会致病菌的丰度,说明EGCG有效缓解热应激引起的肠道菌群失衡,从而改善肠道微生物屏障功能。(2)热应激显著降低巴马香猪结肠中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸的浓度,EGCG显著增加了热应激巴马香猪结肠中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸浓度,从而改善肠道微生物菌群的代谢。(3)热应激激活了结肠组织中TLR4/NF-κB信号通路,显著上调了该信号通路下游炎症基因MIP-1β、MIP-2、COX-2、VCAM-1的表达,EGCG可以有效抑制该信号通路,显著降低其下游炎症基因的表达水平。综上所述,热应激导致巴马香猪的生长性能显著降低,肠道屏障功能严重受损。EGCG改善了巴马香猪的生长性能,并通过降低小肠中热休克蛋白、TLR-4和炎症因子的表达,提高小肠肠道紧密连接蛋白的表达,抑制结肠中TLR4/NF-κB

关键词： EGCG 热应激巴马香猪肠道屏障功能微生物区系

EGCG通过AMPK增强巨噬细胞自噬及其抗结核能力的机制研究

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EGCG通过AMPK增强巨噬细胞自噬及其抗结核能力的机制研究

作者：李梓豪中南大学

学位级别：硕士

目的:本研究将实验室研究与现场流行病学调查结合,分两步研究EGCG增强AMPK调控巨噬细胞自噬及其抗结核能力:首先通过细胞实验探讨和验证EGCG通过磷酸化激活AMPK,抑制mTOR通路的活性,增强巨噬细胞自噬,从而增强其抗结核的能力;然后通过... 详细信息

目的:本研究将实验室研究与现场流行病学调查结合,分两步研究EGCG增强AMPK调控巨噬细胞自噬及其抗结核能力:首先通过细胞实验探讨和验证EGCG通过磷酸化激活AMPK,抑制mTOR通路的活性,增强巨噬细胞自噬,从而增强其抗结核的能力;然后通过人群病例对照研究探讨AMPKα1亚基编码基因PRKAA1的多态性及其与饮茶的交互作用对结核易感性的影响。研究结果将阐明EGCG的抗结核机制,为探索结核病防治新的策略与措施提供理论支持。方法:(1)采用肺泡灌洗的方式获得小鼠肺泡巨噬细胞,分别用低、中、高浓度的EGCG处理巨噬细胞24h,随后用结核分枝杆菌国际标准无毒株(H37Ra)感染4周后,检测各组细胞结核杆菌的感染情况、自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62的表达情况以及对应的m RNA的表达情况,确定EGCG作用的最佳浓度。随后构建AMPK过表达和AMPK沉默的巨噬细胞,用最佳浓度EGCG处理24h后,用H37Ra分别感染4周后,检测各组细胞结核杆菌的感染情况、自噬相关蛋白Beclin-1、LC3、p62的表达情况以及对应的m RNA的表达情况,实验共分为4组:(1)vector组;(2)AMPK过表达组;(3)sh RNA组;(4)sh-AMPK组。(2)采用病例对照研究的方法,选取疾病预防控制中心报告的新发结核病人作为病例组,选取感染过结核分支杆菌但没有发病的正常人作为对照组,签署知情同意后,在两组人群中进行问卷调查收集饮茶等结核病相关危险因素,同时采集5ml外周血EDTA抗凝,提取全基因组DNA保存。采用质谱法对PRKAA1基因各位点进行基因分型,探讨PRKAA1基因多态性及其与饮茶的交互作用对结核易感性的影响。结果:(1)在细胞实验中,与对照组相比,AMPK过表达巨噬细胞MTB16KD绿色荧光减少,巨噬细胞内自噬体膜结构的数量增多,Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达增加,p62蛋白表达减少,AMPK蛋白的表达及其磷酸化水平增加,mTOR蛋白的表达及其磷酸化水平减少;与对照组相比,AMPK沉默巨噬细胞MTB16KD绿色荧光增加,巨噬细胞内自噬体膜结构的数量减少,Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达减少,p62蛋白表达增加,AMPK蛋白的表达及其磷酸化水平减少,mTOR蛋白的表达及其磷酸化水平增加。(2)在病例对照研究中,本研究发现PRKAA1基因rs10074991和rs6882903位点与肺结核患病风险存在关联,rs10074991位点AG基因型和GG基因型是肺结核发病的危险因素,比值比(odd ratio,OR)为别为1.568(95%CI:1.135-2.166),2.008(95%CI:1.368-2.946);rs6882903位点CA基因型和AA基因型是肺结核发病的危险因素,OR为别为1.921(95%CI:1.463-2.524),2.105(95%CI:1.123-3.947)。随后本研究采用边缘结构线性优势比模型的加法模型评价PRKAA1基因的两个多态性位点(rs10074991和rs6882903)与饮茶的相互作用,结果显示饮茶与PRKAA1基因rs6882903多态性对增加肺结核存在易感性存在负交互作用,相对超额危险度RERI值为-1.926(-2.466,-1.386)。结论:(1)EGCG通过上调AMPK磷酸化水平,抑制mTOR磷酸化水平增强小鼠肺泡巨噬细胞自噬及其抗结核能力。(2)PRKAA1基因多态性(rs10074991和rs6882903)与结核病的易感性有关;PRKAA1基因rs6882903位点与饮茶在结核易感性方面存在负交互作用。图11幅,表26个,参考文献73篇

关键词： EGCG AMPK 自噬结核病 PRKAA1 基因多态性饮茶交互作用