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HPV16型E6蛋白诱导PHK多倍体的形成与消除细胞纺锤体检查点无关

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中国肿瘤临床 2009年第1期36卷 38-41页

作者：陈凌沈柱伍津津第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科重庆市400042 第三军医大学西南医院皮肤科

目的：人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus，HPV 16）与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生明确相关。诱导宿主基因组不稳定性可能是HPV16致瘤的重要机制之一。本研究对HPV16型E6蛋白诱导人原代角质形成细胞（primary human keratinoc... 详细信息

目的：人乳头瘤病毒16型（human papillomavirus，HPV 16）与包括宫颈癌在内的多种肿瘤的发生明确相关。诱导宿主基因组不稳定性可能是HPV16致瘤的重要机制之一。本研究对HPV16型E6蛋白诱导人原代角质形成细胞（primary human keratinocytes，PHK）形成多倍体以及对PHK有丝分裂纺锤体检查点的影响进行初步的探索。方法：取正常人包皮组织，分离表皮，常规方法培养PHK。脂质体介导法将pBabe-16e6质粒转染逆转录病毒包装细胞PA317。挑选G418抗性克隆，检测病毒滴度，将表达HPV16型E6蛋白的高滴度逆转录病毒感染PHK。通过逆转录PCR法和免疫印迹法证实HPV16e6成功感染PHK。PHK经Nocodazole处理后，利用流式细胞仪分析多倍体形成，于不同时间点收集细胞、固定，进行抗磷酸化组蛋白染色，利用流式细胞仪分析细胞有丝分裂指数差异。结果：HPV16型e6成功感染PHK，并呈功能性表达。HPV16型e6可诱导PHK形成多倍体，表达E6蛋白的PHK和对照细胞以相似的动力学进入和退出有丝分裂。结论：HPV16型e6对PHK有丝分裂过程中的纺锤体检查点无直接影响，鉴于有丝分裂后期检查点在细胞有丝分裂过程中较持久和严格的作用，本研究结果提示，对有丝分裂后期检查点的作用可能是HPV16型E6蛋白诱导宿主细胞多倍体形成的重要机制。为进一步探讨HPV相关肿瘤的分子发生机制奠定了一定基础。

关键词：人乳头瘤病毒 E6蛋白原代角质形成细胞细胞周期检查点多倍体

HPV16 e6、e7多表位DNA疫苗的构建及免疫效果评估

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昆明医科大学学报 2024年第5期45卷 16-22页

作者：崔湘杰陶玉芬朱兰芳姚宇峰史荔中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118

目的构建和评价HPV16 e6、e7多表位DNA疫苗诱导的特异性CTL细胞应答及其对肿瘤生长的干预作用,从而揭示其作为候选HPV治疗性疫苗的潜能。方法首先通过IeDB网站中的MHC I Processing Predictions和MHC I Binding Predictions方法,分别预... 详细信息

目的构建和评价HPV16 e6、e7多表位DNA疫苗诱导的特异性CTL细胞应答及其对肿瘤生长的干预作用,从而揭示其作为候选HPV治疗性疫苗的潜能。方法首先通过IeDB网站中的MHC I Processing Predictions和MHC I Binding Predictions方法,分别预测人类HLA-A^(*)02:01、HLA-A^(*)11:01、HLA-A^(*)24:02和C57BL/6小鼠H-2b的限制性CTL表位,然后根据评分以及eLISPOT实验筛选出二者共同呈递的CTL表位,并将其构建成多表位DNA疫苗(pVAX1-10P)。从预防性和治疗性二个方面研究pVAX1-10P对小鼠移植TC-1异位癌的免疫干预作用,流式细胞术检测特异性CTL应答。结果获得10条可被人与鼠MHC分子共呈递的CTL表位,eLISPOT结果表明这10条CTL表位均能诱导小鼠淋巴细胞产生特异性免疫应答;由此构建的多表位DNA疫苗pVAX1-10P无论在预防性实验还是治疗性实验中,均能诱导特异性的细胞免疫并抑制肿瘤的生长。结论构建的HPV16 e6、e7多表位DNA疫苗pVAX1-10P能够诱导特异性CTL应答,显著抑制肿瘤生长,有望作为候选HPV治疗性DNA疫苗。

关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒16 E6蛋白 e7蛋白多表位DNA疫苗

人乳头瘤病毒致癌特性及其e6和e7蛋白致癌机制的研究进展

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吉林大学学报（医学版） 2018年第5期44卷 1096-1099页

作者：薛亚娟符兆英延安大学医学院病原生物学教研室陕西延安716000 延安大学分子生物学与免疫学研究所陕西延安716000

人乳头瘤病毒(HPV)是一种感染人的乳头瘤病毒科病毒,主要感染上皮细胞,其高危型别(主要是16和18型)可引起恶性肿瘤。高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合入细胞基因组,并由于其e2基因表达障碍不能有效抑制e6、e7基因转录而持续高表达e6... 详细信息

人乳头瘤病毒(HPV)是一种感染人的乳头瘤病毒科病毒,主要感染上皮细胞,其高危型别(主要是16和18型)可引起恶性肿瘤。高危型HPV感染上皮细胞后,其DNA能整合入细胞基因组,并由于其e2基因表达障碍不能有效抑制e6、e7基因转录而持续高表达e6和e7 2种癌蛋白。e6和e7蛋白可分别抑制P53蛋白和pRb蛋白的作用而使细胞周期失控,在细胞基因组受到损伤时细胞周期仍然向前进展;E6蛋白能通过影响多种凋亡调节蛋白或因子的表达而抑制细胞凋亡;E6蛋白和e7蛋白能协同作用上调端粒酶的表达而使细胞永生化;以上机制最终导致受感染细胞发生恶性转化或癌变。本文对HPV的致癌特性及其所表达的E6蛋白和e7蛋白扰乱细胞周期、抑制细胞凋亡并活化端粒酶使细胞永生化的致癌机制的研究进展进行了综述。

关键词：人乳头瘤病毒 E6蛋白 e7蛋白细胞周期细胞凋亡端粒酶

分子动力学模拟HPV(16,18)E6蛋白

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现代生物医学进展 2018年第4期18卷 610-615页

作者：张雯雯康文渊邹金晶毕振飞豆荣昆茆灿泉西南交通大学生命科学与工程学院四川成都610031

目的:对人乳头瘤病毒HPV16,18中E6蛋白结构进行分子模拟和分析,寻找可以作为蛋白-配体相互作用的关键结构区域。方法:以HPV16 E6蛋白为模板,对HPV18 E6蛋白进行同源建模,对构建的HPV18 e6模型以及晶体结构模型HPV16 e6进行分子动力学模... 详细信息

目的:对人乳头瘤病毒HPV16,18中E6蛋白结构进行分子模拟和分析,寻找可以作为蛋白-配体相互作用的关键结构区域。方法:以HPV16 E6蛋白为模板,对HPV18 E6蛋白进行同源建模,对构建的HPV18 e6模型以及晶体结构模型HPV16 e6进行分子动力学模拟,通过微观上的loop环分析和宏观上的整体运动分析研究了HPV18 e6与HPV16 e6在溶剂环境下结构变化的异同。结果:发现靠近N端loop环在蛋白-配体结合过程中能介导控制配体、水、离子进出的"门控"的作用,解释了两个蛋白在水溶剂中的运动构象的变化。结论:本研究解释了HPV16 e6与HPV18 e6两个蛋白在溶剂中的运动机制,并发现了loop环在其中扮演"门控"的作用,解释了两个蛋白在水溶剂中的运动构象的变化,该发现能够为基于两个蛋白为靶点的药物设计提供理论依据。

关键词： HPV E6蛋白同源建模分子动力学模拟

Daxx与HPV16 E6蛋白相互作用及与PML在宫颈癌细胞中的定位

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Daxx与HPV16 E6蛋白相互作用及与PML在宫颈癌细胞中的定位

作者：范瑞岗南华大学

学位级别：硕士

目的研究Daxx与HPV16E6蛋白相互作用的氨基酸结构域,分析宫颈癌细胞内PML和Daxx勺定位,为进一步研究高危型HPV16和HPV18的致癌机制奠定试验基础。方法(1)用PRIMeR5.0软件分别设计Daxx基因片段(氨基酸1-240、241-500、501-625和626-740... 详细信息

目的研究Daxx与HPV16E6蛋白相互作用的氨基酸结构域,分析宫颈癌细胞内PML和Daxx勺定位,为进一步研究高危型HPV16和HPV18的致癌机制奠定试验基础。方法(1)用PRIMeR5.0软件分别设计Daxx基因片段(氨基酸1-240、241-500、501-625和626-740)特异性引物,并引入NdeI和Sa1I酶切位点,PCR扩增目的基因。分别经NdeI和Sa1l双酶切PCR产物和质粒pGBKT7,纯化回收酶切产物,T4连接酶连接后,转化e.coli JM109,筛选阳性克隆。对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析。(2)应用LiAC法,分别将诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7-Daxx、pGBKT7-Daxx-DM1-240、 pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625、pGBKT7-Daxx-DM626-740与猎物质粒pGADT7和pGADT7-e6转化酵母菌AH109,涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-His、 SD/-Ade(单缺)固体培养基上,30℃培养2-4d,检测诱饵质粒和猎物质粒对酵母菌AH109的自激活作用。 (3)将质粒分为8组,它们分别是A组(pGADT7+pGBKT7)、B组(pGADT7-T+pGBKT7-Lam)、C组(pGADT7-T+pGBKT7-p53)、D组(pGADT7-e6+pGBKT7-Daxx)、e组(pGADT7-e6+pGBKT7-Daxx-DM1-240)、F组(pGADT7-e6+pGBKT7-Daxx-DM240-500)、G组(pGADT7-e6+pGBKT7-Daxx-DM501-625)和H组(pGADT7-e6+pGBKT7-Daxx-DM626-740)。(?)每组质粒共转化酵母菌AH109,转化菌分别接种于SD/-Trp-Leu(二缺陷)固体培养基,30℃培养2-4d,待平板上长出菌落后,接种单个菌落于SD/-Trp-Leu-His(三缺陷)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺陷)平板上,30℃培养2-4d,观察酵母菌的生长情况,分析Daxx与HPV16e6相互作用的氨基酸结构域。 (4)分别以抗Daxx抗体或抗HPV e6抗体对转染pcDNA3.1(-)/HPV16e6(?)的Hela细胞进行免疫共沉淀分析,确定HPV16e6与Daxx在细胞内是否存在相互作用。 (5)分别培养HeLa细胞和Caski细胞,利用间接免疫荧光实验,在激光共聚焦显微镜下观察并分析PML和Daxx在细胞内的定位;分析Caski细胞中Daxx与HPV16E6蛋白定位。结果(1)DNA测序结果显示Daxx基因片段(氨基酸1-240、241-500、501-625和626-740)分别正确地连接入pGBKT7载体,即成功构建了重组质粒pGBKT7-Daxx-DM1-240、 pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625和pGBKT7-Daxx-DM626-740。 (2)转化了诱饵质粒pGBKT7、pGBKT7-Daxx、pGBKT7-Daxx-DM1-240、pGBKT7-Daxx-DM241-500、pGBKT7-Daxx-DM501-625和pGBKT7-Daxx-DM626-740的酵母菌AH109,在SD/-Trp固体培养基上可见菌落生长,而在SD/-Leu、SD/-His、SD/-Ade未见菌落生长。转化了猎物质粒pGADT7、pGADT7-e6的酵母菌AH109,在SD/-Leu固体培养基上可见菌落生长,SD/-Trp、SD/-His、SD/-Ade培养板上未见菌落生长,即诱饵质粒和猎物质粒均无自激活作用。 (3)A-G组质粒转化的酵母菌在SD/-Trp-Leu (二缺陷)平板上均可见菌落生长。在SD/-Trp-Leu-His(三缺陷)和SD/-Trp-Leu-His-Ade(四缺陷)平板上,只有C、D、H组转化菌生长,A、B、e、F、G组未见菌落生长。 (4)细胞内免疫共沉淀结果显示,在用抗Daxx抗体沉淀Daxx的同时,HPV16E6蛋白一同被沉淀;而用抗HPV e6抗体在沉淀E6蛋白的同时,Daxx也一同被沉淀,即HPV16e6与Daxx在Hela细胞内发生了结合反应。 (5)在Caski细胞,HPV16e6和Daxx在细胞核中的分布不均匀,呈区域性聚集;表达红色荧光蛋白的HPV16e6与表达绿色荧光蛋白的Daxx重叠成黄色信号,即两者在Caski细胞中有共定位。 (6)在HeLa细胞和Caski细胞,PML红色信号和Daxx绿色信号在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布;Daxx绿色信号与PML红色信号重叠时,依然显示各自的绿色信号与红色信号。结论(1)构建的重组体pGBKT7-Daxx-DM1-240、pGBKT7-Daxx-DM241-50

关键词：人乳头瘤病毒16型(HPV16) E6蛋白 Daxx 酵母双杂交免疫共沉淀定位

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HPV58型E6蛋白B细胞表位预测与分析

温州医科大学学报 2018年第8期48卷 547-551页

作者：叶晓鲜毛珊珊宋易玲王路得蒋朋飞朱珊丽张丽芳温州医科大学微生物学与免疫学教研室浙江温州325035

目的:预测分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)58型E6蛋白的B细胞线性表位及其结构。方法:从瑞士生物信息研究所提供的Swissprot蛋白质数据库中检索到E6蛋白序列,采用计算机辅助生物信息学软件进行分析,用expasy服务器在线软件分析预测E6蛋白... 详细信息

目的:预测分析高危型人乳头瘤病毒(HPV)58型E6蛋白的B细胞线性表位及其结构。方法:从瑞士生物信息研究所提供的Swissprot蛋白质数据库中检索到E6蛋白序列,采用计算机辅助生物信息学软件进行分析,用expasy服务器在线软件分析预测E6蛋白的理化性质、二级结构及三维空间结构,采用DNASTAR软件包中的protean软件进一步分析亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原性与极性等特性,再结合氨基酸抗原指数(AI)计算法算出平均AI,根据AI大小预测HPV58型E6蛋白的B细胞线性表位的可能肽段,并进行同源性匹配分析。结果:HPV58型E6蛋白的B细胞线性表位可能位于以下肽段位置:N端8~15(KPRTLHDL)、27~44(eLKCVeCKKTLQRSeVYD)、108~127(RPLCPQeKKRHVDLNKRFHN)、141~147(RPRRRQT)肽段及其周围。同源性分析得出肽段27~44、141~147为可能的B细胞线性表位,为HPV58型E6蛋白B细胞表位的独特序列,肽段8~15与HPV33型E6蛋白同源性匹配为100%,108~127与HPV33型e6、HPV9型E6蛋白同源性匹配为100%。结论:27~44、141~147肽段为可能的HPV58型E6蛋白的B细胞优势表位。

关键词： HPV58型 E6蛋白 B细胞表位预测生物信息学分析

宫颈癌前病变及宫颈鳞癌中HPV16型E6蛋白与p73蛋白的表达及临床意义

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宫颈癌前病变及宫颈鳞癌中HPV16型E6蛋白与p73蛋白的表达及临床意...

作者：李敏青岛大学

学位级别：硕士

目的:研究宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈鳞癌中人乳头瘤病毒(HPV)16型E6蛋白与p73蛋白的表达情况,分析HPV16型E6蛋白与p73蛋白之间的相关性,讨论两者在宫颈病变发生过程中的临床意义。方法:将正常宫颈组织10例、宫颈上皮内瘤变组织22例、... 详细信息

目的:研究宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈鳞癌中人乳头瘤病毒(HPV)16型E6蛋白与p73蛋白的表达情况,分析HPV16型E6蛋白与p73蛋白之间的相关性,讨论两者在宫颈病变发生过程中的临床意义。方法:将正常宫颈组织10例、宫颈上皮内瘤变组织22例、宫颈鳞癌组织38例的组织切片进行免疫组织化学技术(PV-6000法)处理,检测两者的表达情况,分析HPV16型E6蛋白、p73蛋白与宫颈鳞癌相关病理特征的关系。结果:HPV16-E6蛋白在正常宫颈组织、上皮内瘤变组织和宫颈鳞癌组织中的阳性率依次为:0、40.9%和78.9%,三组之间差异有显著性意义(P蛋白在以上三种组织中的阳性率分别为:80.0%、59.1%和21.1%,三组之间差异有显著性意义(P6-e6表达与组织分化程度有关,与是否有淋巴结转移、患者的发病年龄、临床分期和肿瘤大小无相关性。在正常组、CIN组和鳞癌组之间HPV16-e6、p73蛋白表达的阳性率呈负相关(rs=-0.301,P=0.011)。结论:HPV16-e6高表达可能与宫颈鳞癌的发生及发展过程密切相关。p73蛋白的阳性率随宫颈病变的进展过程呈逐渐降低的趋势,提示p73蛋白表达升高不利于宫颈肿瘤发展,p73蛋白可能在宫颈肿瘤的发展过程中起抑制作用。

关键词：宫颈癌宫颈上皮内瘤变人乳头瘤病毒 E6蛋白 p73

HPV e6/e7 mRNA检测、LCT及HPV L1壳蛋白联合检验在宫颈癌筛查中的意义

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医药论坛杂志 2022年第23期43卷 94-98页

作者：张艳艳董学彩高玉霞王文翔郭祥翠新乡市中心医院妇瘤科新乡医学院第四临床学院河南新乡453000

目的探讨高危人乳头瘤病毒(HPV)e6/e7mRNA、超薄液基细胞学检测(LCT)、HPV L1壳蛋白联合监测在宫颈癌筛查中的价值。方法选择2017年3月至2019年6月于新乡市中心医院妇科门诊就诊的367例行宫颈LCT检查的女性为研究对象,采用分支链DNA信... 详细信息

目的探讨高危人乳头瘤病毒(HPV)e6/e7mRNA、超薄液基细胞学检测(LCT)、HPV L1壳蛋白联合监测在宫颈癌筛查中的价值。方法选择2017年3月至2019年6月于新乡市中心医院妇科门诊就诊的367例行宫颈LCT检查的女性为研究对象,采用分支链DNA信号放大技术检测HPV e6/e7mRNA,免疫组化检测HPV L1壳蛋白表达。72例受试者行阴道镜宫颈组织活检,根据病理诊断结果分析联合HPV e6/e7 mRNA、LCT、HPV L1壳蛋白检测在宫颈癌筛查中的价值。结果72例经阴道镜组织活检证实宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅰ级8例,CINⅡ级6例,CINⅢ级4例,宫颈原位癌3例。意义不明不典型鳞状细胞和腺细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)组织HPV e6/e7mRNA阳性表达率高于正常/炎症组织(Pe6/e7mRNA阳性表达率高于ASCUS组织(P蛋白阳性表达率高于正常/炎症、ASCUS、HSIL组织(P蛋白阳性表达率高与正常/炎症组织(Pe6/e7 mRNA、LCT、HPV L1壳蛋白鉴别诊断宫颈癌CINⅠ级/Ⅱ级的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为94.44%、97.22%、97.14%、94.59%。结论HPV e6/e7 mRNA、LCT、HPV L1壳蛋白在宫颈癌筛查中均具有一定价值,联合三项检查可提高宫颈癌筛查效能。

关键词：高危人乳头瘤病毒 E6蛋白 e7蛋白超薄液基细胞学检测 HPV L1衣壳蛋白

人乳头瘤病毒e6/e7混合CTL表位的筛选与免疫效应研究

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中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 2024年第1期 0115-0120页

作者：张汶歌姚德生广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科广西南宁530000

验证有效的人乳头瘤病毒(HPV)e6、e7蛋白的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,比较混合表位和单个表位的体外免疫效应差异,为宫颈癌复合多肽疫苗研究提供基础。方法对宫颈癌相关抗原 HPV e6、e7蛋白CTL表位进行筛选,采用HLA... 详细信息

验证有效的人乳头瘤病毒(HPV)e6、e7蛋白的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位,比较混合表位和单个表位的体外免疫效应差异,为宫颈癌复合多肽疫苗研究提供基础。方法对宫颈癌相关抗原 HPV e6、e7蛋白CTL表位进行筛选,采用HLA-A2分子结合力实验检测T2细胞的表面平均荧光强度(MIF),采用酶联免疫斑点法(eLISOPT)检测IFN-γ斑点数,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测吸光度(OD)。结果对已报道的 11条表位多肽进行验证,经过T2细胞肽结合力绑定实验、eLISPOT实验,结果表明,多肽P2 TIHDIILeCV、P3 FAFRDLCIV、P5 YMLDLQPeT、P9 eLTeVFeFA、P11 TLQDIVLHL均具有高免疫反应性,与健康志愿者相比,5条多肽能够刺激宫颈癌患者外周血CTL产生特异性反应,由混合表位诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用明显优于单个表位的作用。结论验证了5条多肽序列具有免疫反应性,明确了混合表位体外免疫效应优于单个表位,为进一步开展宫颈癌复合多肽疫苗的研究奠定了基础。

关键词：宫颈癌人乳头瘤病毒 E6蛋白 e7蛋白 HLA-A2 限制性 CTL 表位