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着床相关基因E4BP4与COMT在子宫内膜异位症在位子宫内膜中的表达...

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作者：杜惠复旦大学

学位级别：硕士

第一部分目的通过研究着床相关基因腺病毒e4启动子结合蛋白—4(e4bp4)在子宫内膜异位症(内异症,eM)患者在位子宫内膜中的表达变化及分布,探讨内异症关联性不孕的分子机制。方法选取eM患者与非eM患者各13例,分别取其增生期(proliferati... 详细信息

第一部分目的通过研究着床相关基因腺病毒e4启动子结合蛋白—4(e4bp4)在子宫内膜异位症(内异症,eM)患者在位子宫内膜中的表达变化及分布,探讨内异症关联性不孕的分子机制。方法选取eM患者与非eM患者各13例,分别取其增生期(proliferativeendometrium,Pe)和分泌期子宫内膜(secretory endometrium,Se)。采用RT-PCR、real-time quantitative PCR和Western blowing从mRNA和蛋白水平对e4bp4的表达变化进行分析。免疫组化检测e4bp4蛋白在两组内膜中的分布。结果分泌期及增生期eM组e4bp4 mRNA及蛋白水平显著下调,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);e4bp4蛋白主要分布于子宫内膜腺上皮及基质的胞浆与胞核中,在分泌期,内异症组e4bp4蛋白含量水平与对照组相比明显下降,而增生期两者差异不明显。结论e4bp4在子宫内膜异位症患者在位子宫内膜中的表达下调,提示e4bp4可能参与介导eM对胚胎着床的影响。第二部分目的探讨着床相关基因儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)在小鼠动情周期及eM患者在位子宫内膜中的表达调控规律,为其参与调节生殖过程的作用机制提供新的证据。方法 1.采用RT-PCR,real-time quantitative PCR和Western blotting检测成年小鼠动情周期不同时相以及孕第7天鼠的子宫、卵巢中COMT表达有无变化。 2.性成熟前小鼠分别用e(苯甲酸雌二醇)、P(孕酮)、e+Tam(苯甲酸雌二醇+他莫昔芬)、P+R(孕酮+米非司酮)处理,检测其子宫和卵巢中COMT mRNA水平有无变化。 3.采用Western blotting及RT-PCR检测COMT在eM患者及对照组在位子宫内膜中的表达变化。结果 1.成年小鼠子宫与卵巢中COMT mRNA和蛋白水平在动情期较高,与其它时相相比,差异有统计学意义(P＜0.05);孕第7天小鼠子宫的COMT mRNA水平有下降趋势,与未孕小鼠相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。 2.性成熟前小鼠子宫中COMT mRNA水平各激素处理组间均无差异(P＞0.05),而在性成熟前小鼠各激素处理组的卵巢中却显示苯甲酸雌二醇(e)组COMT mRNA偏低,e+Tam(他莫昔芬)组中COMT mRNA较高,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3.内异症患者分泌期、增生期子宫内膜中COMT mRNA和蛋白水平与对照组相比,差异均不具统计学意义(P＞0.05)。结论 1.小鼠COMT mRNA水平随动情周期变化,而且与妊娠有关;雌激素对COMT的生物合成具有负调节作用,而且这种作用可能是通过雌激素受体依赖性方式进行。 ***与内异症胚胎种植微环境的改变之间无明显相关性。第三部分目的应用基因芯片技术比较eM患者与对照组分泌期子宫内膜基因表达谱的差异,探讨内异症关联性不孕的分子机制。方法应用基因芯片检测eM组(n=8)和非eM组(n=9)分泌期子宫内膜的基因表达谱,筛选表达水平出现差异变化的基因,结合信息学工具和文献检索,分析筛出基因发生表达变化的生理与病理学意义。结果经过基因芯片检测,在eM组分泌期子宫内膜的基因表达谱中,有186个基因表达上调大于2倍,而236个基因表达下调小于0.5倍。通过KeGG和Genemap数据库的生物学过程分析,说明可能通过影响细胞信号转导,调节炎症因子及细胞粘附与分化等生物学过程,导致胚胎着床微环境发生异常改变。结论eM患者子宫内膜基因表达谱的变化反映了子宫内膜异位症可能对胚胎着床的影响,为进一步的分子机制研究提供了基因靶点。

关键词： e4bp4 子宫内膜异位症胚胎着床 COMT 小鼠动情周期基因芯片

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miR-199a-5p调控药物代谢酶CYP2B10的研究

miR-199a-5p调控药物代谢酶CYP2B10的研究

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作者：任舒静暨南大学

学位级别：硕士

目的:microRNA是一种高度保守的非编码RNA,通常由20-25个核苷酸构成,可调控药物代谢酶的表达,改变药物代谢,从而影响药物疗效和毒性。miR-199a-5p是许多生物过程(如细胞增殖、分化和肌源性分化)和疾病(如肿瘤)的重要调控因子。CYP2B10... 详细信息

目的:microRNA是一种高度保守的非编码RNA,通常由20-25个核苷酸构成,可调控药物代谢酶的表达,改变药物代谢,从而影响药物疗效和毒性。miR-199a-5p是许多生物过程(如细胞增殖、分化和肌源性分化)和疾病(如肿瘤)的重要调控因子。CYP2B10是肝脏中重要的药物代谢酶之一,负责环磷酰胺和安非他酮等多种临床药物的代谢与解毒。然而,miR-199a-5p是否对CYP2B10有调控作用目前尚不清楚。本论文工作旨在明确miR-199a-5p对CYP2B10的调控作用,并阐明其分子机制。方法:1.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting),分别检测mRNA和蛋白的表达水平。2.采用JetPRIMeTM转染试剂盒,将miR-199a-5p模拟物转染于AML-12细胞,检测CYP(Cyp1a1、Cyp1a2、Cyp2a5、Cyp2b10、Cyp2c19、Cyp2d9、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp2j5和Cyp3a11)mRNA表达水平,筛选出具有显著变化的CYP。3.将miR-199a-5p的模拟物或抑制剂转染于AML-12细胞,检测CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平,考察miR-199a-5p对CYP2B10表达的影响。4.将miR-199a-5p模拟物或对照转染于AML-12细胞。24小时后,将AML-12细胞原培养基更换为含环磷酰胺(CYP2B10的特异性底物)的培养基,孵育1小时。采用UPLC-QTOF/MS法检测环磷酰胺及其代谢物(四羟基环磷酰胺)的浓度,考察miR-199a-5p对CYP2B10代谢活性的影响。5.将已知的CYP负调控因子(Shp、Nr1d1和e4bp4)质粒分别转染于AML-12细胞,检测Cyp2b10 mRNA表达,筛选能显著调控Cyp2b10的转录因子。6.将e4bp4高表达质粒或sie4bp4转染于AML-12细胞,检测细胞中CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平。采用双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验探究e4bp4对CYP2B10的调控机制。7.将miR-199a-5p的模拟物或抑制剂转染于AML-12细胞,检测细胞中e4bp4 mRNA和蛋白的表达水平。使用TargetScan和miRDB数据库,预测miR-199a-5p与e4bp43’-UTR的潜在结合位点。构建e4bp43’-UTR全长序列和结合位点突变序列,采用双荧光素酶报告基因实验,探究miR-199a-5p调控e4bp4的作用机制。结果:***-199a-5p增强CYP2B10的表达及环磷酰胺代谢miR-199a-5p在小鼠的心、肝、脾、肺和肾中均有表达,在肝脏中表达量最高。miR-199a-5p模拟物增加了 AML-12细胞中Cyp2b10、Cyp2c19和Cyp2j5的mRNA表达,其中Cyp2b10的表达变化最为显著。同时,CYP2B10蛋白表达也显著增加。此外,miR-199a-5p抑制剂降低了 AML-12细胞中CYP2B10的mRNA和蛋白表达。以上结果表明,miR-199a-5p对CYP2B10具有正向调控作用。miR-199a-5p模拟物显著增加了 AML-12细胞中环磷酰胺毒性代谢物(四羟基环磷酰胺)的产生,这提示miR-199a-5p增强了环磷酰胺的代谢。2.e4bp4调控CYP2B10的转录和表达TargetScan和miRDB数据库的预测结果表明,Cyp2b10不可能是miR-199a-5p的直接靶基因。因此,miR-199a-5p可能以间接的方式调控CYP2B10。由于miR-199a-5p正向调控CYP2B10的表达(miR-199a-5p通常负向调控靶基因),因此我们推测负调控因子介导miR-199a-5p对CYP2B10的调控作用。在CYP的负调控因子(SHP、NR1D1和e4bp4)中,仅有e4bp4对CYP2B10有显著的抑制作用。e4bp4过表达下调了 AML-12细胞中CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平,而e4bp4的敲低上调了 CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平。在AML-12细胞中,e4bp4过表达降低了Cyp2b10启动子活性。此外,e4bp4可特异性结合于Cyp2b10启动子的D-box,抑制Cyp2b10的转录活性。因此,e4bp4可在转录水平调控CYP2B10。***-199a-5p抑制e4bp4的蛋白表达基于TargetScan和miRDB数据库分析,e4bp4可能是miR-199a-5p的直接靶基因。因此,我们进一步验证miR-199a-5p对e4bp4的调控作用。在AML-12细胞中,miR-199a-5p模拟物降低了 e4bp4蛋白表达水平,而miR-199a-5p抑制剂提高

关键词： miR-199a-5p e4bp4 CYP2B10 药物代谢

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