miR-199a-5p调控药物代谢酶CYP2B10的研究

作     者：任舒静 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴宝剑

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：miR-199a-5p E4BP4 CYP2B10 药物代谢 

摘      要：目的:microRNA是一种高度保守的非编码RNA,通常由20-25个核苷酸构成,可调控药物代谢酶的表达,改变药物代谢,从而影响药物疗效和毒性。miR-199a-5p是许多生物过程(如细胞增殖、分化和肌源性分化)和疾病(如肿瘤)的重要调控因子。CYP2B10是肝脏中重要的药物代谢酶之一,负责环磷酰胺和安非他酮等多种临床药物的代谢与解毒。然而,miR-199a-5p是否对CYP2B10有调控作用目前尚不清楚。本论文工作旨在明确miR-199a-5p对CYP2B10的调控作用,并阐明其分子机制。方法:1.采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting),分别检测mRNA和蛋白的表达水平。2.采用JetPRIMETM转染试剂盒,将miR-199a-5p模拟物转染于AML-12细胞,检测CYP(Cyp1a1、Cyp1a2、Cyp2a5、Cyp2b10、Cyp2c19、Cyp2d9、Cyp2d22、Cyp2e1、Cyp2j5和Cyp3a11)mRNA表达水平,筛选出具有显著变化的CYP。3.将miR-199a-5p的模拟物或抑制剂转染于AML-12细胞,检测CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平,考察miR-199a-5p对CYP2B10表达的影响。4.将miR-199a-5p模拟物或对照转染于AML-12细胞。24小时后,将AML-12细胞原培养基更换为含环磷酰胺(CYP2B10的特异性底物)的培养基,孵育1小时。采用UPLC-QTOF/MS法检测环磷酰胺及其代谢物(四羟基环磷酰胺)的浓度,考察miR-199a-5p对CYP2B10代谢活性的影响。5.将已知的CYP负调控因子(Shp、Nr1d1和E4bp4)质粒分别转染于AML-12细胞,检测Cyp2b10 mRNA表达,筛选能显著调控Cyp2b10的转录因子。6.将E4bp4高表达质粒或siE4bp4转染于AML-12细胞,检测细胞中CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平。采用双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀实验探究E4BP4对CYP2B10的调控机制。7.将miR-199a-5p的模拟物或抑制剂转染于AML-12细胞,检测细胞中E4BP4 mRNA和蛋白的表达水平。使用TargetScan和miRDB数据库,预测miR-199a-5p与E4bp43’-UTR的潜在结合位点。构建E4bp43’-UTR全长序列和结合位点突变序列,采用双荧光素酶报告基因实验,探究miR-199a-5p调控E4BP4的作用机制。结果:***-199a-5p增强CYP2B10的表达及环磷酰胺代谢miR-199a-5p在小鼠的心、肝、脾、肺和肾中均有表达,在肝脏中表达量最高。miR-199a-5p模拟物增加了 AML-12细胞中Cyp2b10、Cyp2c19和Cyp2j5的mRNA表达,其中Cyp2b10的表达变化最为显著。同时,CYP2B10蛋白表达也显著增加。此外,miR-199a-5p抑制剂降低了 AML-12细胞中CYP2B10的mRNA和蛋白表达。以上结果表明,miR-199a-5p对CYP2B10具有正向调控作用。miR-199a-5p模拟物显著增加了 AML-12细胞中环磷酰胺毒性代谢物(四羟基环磷酰胺)的产生,这提示miR-199a-5p增强了环磷酰胺的代谢。2.E4BP4调控CYP2B10的转录和表达TargetScan和miRDB数据库的预测结果表明,Cyp2b10不可能是miR-199a-5p的直接靶基因。因此,miR-199a-5p可能以间接的方式调控CYP2B10。由于miR-199a-5p正向调控CYP2B10的表达(miR-199a-5p通常负向调控靶基因),因此我们推测负调控因子介导miR-199a-5p对CYP2B10的调控作用。在CYP的负调控因子(SHP、NR1D1和E4BP4)中,仅有E4BP4对CYP2B10有显著的抑制作用。E4bp4过表达下调了 AML-12细胞中CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平,而E4bp4的敲低上调了 CYP2B10 mRNA和蛋白的表达水平。在AML-12细胞中,E4BP4过表达降低了Cyp2b10启动子活性。此外,E4BP4可特异性结合于Cyp2b10启动子的D-box,抑制Cyp2b10的转录活性。因此,E4BP4可在转录水平调控CYP2B10。***-199a-5p抑制E4BP4的蛋白表达基于TargetScan和miRDB数据库分析,E4BP4可能是miR-199a-5p的直接靶基因。因此,我们进一步验证miR-199a-5p对E4BP4的调控作用。在AML-12细胞中,miR-199a-5p模拟物降低了 E4BP4蛋白表达水平,而miR-199a-5p抑制剂提高